MVBs及IL-1β在2型糖尿病大鼠血管鈣化中的作用

鄭 楊，魏海軍，申嘉陵， 劉潤禹，劉 勇，孫曉磊

(西南醫科大學附屬醫院 血管外科， 四川 瀘州 646000)

心血管疾病是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者死亡的主要原因[1-2]，其中血管鈣化(vascular calcification，VC)是一個重要的危險因素[3]，是糖尿病患者心血管死亡率的最佳預測指標[4-5]。臨床證據表明VC通常影響T2DM人群的內側動脈層，但其發生發展的分子生物學機制仍然存在較大的爭議。因此，需進一步明確糖尿病血管鈣化的分子病理機制。

近年來大量研究發現，當血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)受到氧化應激、炎性因子等刺激，會釋放基質囊泡(matrix vesicles bodies，MVBs)至細胞外基質，形成易于鈣磷沉積的微環境，從而啟動血管鈣化的發生[6]。另一方面，白細胞介素 1β(interleukin 1β，IL-1β)是T2DM患者靶向的主要炎性細胞因子，其分泌與自噬、MVBs形成和微囊泡脫落等有關[7]。體內IL-1β水平升高與血管鈣化密切相關[8-9]，而MVBs釋放增加可以使磷酸鹽誘導的血管鈣化加重。然而，在T2DM相關的血管鈣化中， MVBs如何促進鈣化以及IL-1β如何參與其中仍然未知。因此，本文就MVBs及炎性介質IL-1β在2型糖尿病血管鈣化中的作用展開進一步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級雄性SD大鼠，體質量200～250 g{西南醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(川)2013-17]}。所有動物實驗均已獲得西南醫科大學實驗倫理委員會批準(20160059)。β-磷酸甘油(β-Glycerophosphate，β-GP)、雷帕霉素、氯喹(Sigma Aldrich公司)、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Solarbio公司)、獸用維生素D3(哈爾濱摩天農科獸藥有限公司)；annexin-Ⅵ、IL-1β一抗(Abcam公司)；RUNX 2一抗(Cell Signaling Technology公司)；RNA反轉錄試劑盒、PCR試劑盒(Toyobo公司)；引物(成都擎科生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分成正常組和糖尿病組(腹腔注射STZ)，以空腹血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病模型造模成功，隨后給糖尿病大鼠每天肌肉注射維生素D3(7.5 mg/kg)，連續注射30 d，制備糖尿病大鼠血管鈣化模型。每組8只。

1.2.2 血管Von Kossa 染色檢測血管鈣化：石蠟切片常規處理后，按照全組織Von Kossa 染色試劑盒(solarbio)說明書進行染色，于顯微鏡下觀察動脈鈣化。

1.2.3 原代大鼠主動脈VSMCs的分離及鈣化細胞模型的建立：1)原代大鼠主動脈VSMCs分離培養：肌肉注射1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg)麻醉大鼠，無菌條件下迅速取出胸主動脈，小心剝離血管周圍結締組織，貼塊法培養VSMCs。2)細胞分組及鈣化模型建立：對照組(control)：用含10%胎牛血清的DME-/F12培養基正常培養VSMCs；鈣化組(calcification)：將VSMCs用含10%胎牛血清和10 mmol/L β-GP的高糖DMEM培養基進行培養，3 d更換1次新鮮培養基，誘導培養7 d，建立細胞高糖鈣化模型。

1.2.4 茜素紅染色檢測鈣化結節：將細胞接種于6孔板內，設置對照組和鈣化組，培養7 d后用PBS洗滌，按照細胞茜素紅染色試劑盒(Solarbio公司)說明書染色，于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.2.5 免疫熒光染色檢測RUNX 2、annexin-Ⅵ及IL-1β的表達：用4%多聚甲醛固定切片或細胞10 min，PBS洗滌后用0.2% Triton X-100和5% 驢血清室溫共孵育2 h。之后加RUNX 2(1∶600)、annexin-Ⅵ(1∶600)、IL-1β(1∶100)一抗4 ℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌后加入熒光二抗(1∶500)室溫避光孵育2 h。PBS再次洗滌，吸干液體，用含DAPI的水性封片劑封片，熒光鏡檢。

1.2.6 Western blot檢測RUNX 2、annexin-Ⅵ蛋白表達：提取VSMCs總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，檢測各組細胞中RUNX 2(1∶1 000)、Annexin-Ⅵ(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)的表達。總蛋白相對表達量=總蛋白條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值。

1.2.7 RT-qPCR檢測RUNX 2、BMP-2、annexin-Ⅵ、IL-1β mRNA表達：用Nucleozol試劑盒提取VSMCs總RNA，反轉錄得到cDNA，配制20 μL的實時熒光定量PCR體系，進行實時熒光定量。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環40次。反應結束后，計算2-△△Ct值進行統計分析。引物見表1。

表1 反應引物Table 1 Primer

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 2型糖尿病大鼠血管鈣化指標檢測

腹腔注射STZ+肌肉注射維生素D3誘導糖尿病大鼠血管鈣化模型(圖1A)，STZ注射1周后，大鼠血糖顯著升高(圖1B，P<0.01)。18F-NaF-PET/CT影像學檢查，鈣化組CT顯像發現明顯斑塊，且該部位18F-NaF高攝取濃聚(圖1C，白色箭頭)。大鼠主動脈的Von Kossa染色結果進一步證實鈣化組大鼠有明顯黑色鈣鹽銀染顆粒沉積(圖2)(P<0.05)。

A.establishment of vascular calcification model in diabetic rats; STZ, Streptozotocin; B.rat blood glucose level; *P<0.01 compared with the control group; C.18F-NaF-PET/CT imaging圖1 糖尿病大鼠血管鈣化模型建立Fig 1 Model of diabetic rats with vascular

A.representative image of Von Kossa staining of rat aorta (scale bar: 200 μm, 100 μm); B.the statistical graph of Fig A;*P<0.05 compared with the control group圖2 大鼠主動脈Von Kossa染色Fig 2 Von Kossa staining of rat

2.2 各組大鼠主動脈中RUNX2、annexin-Ⅵ、IL-1β 的表達

與對照組相比，糖尿病血管鈣化大鼠主動脈中促鈣化基因RUNX 2、MVBs的標志物annexin-Ⅵ和炎性介質IL-1β的熒光強度明顯增強(圖3)。

A.RUNX 2; B.annexin-Ⅵ; C.IL-1β; scale bar=100 μm圖3 大鼠主動脈免疫熒光染色Fig 3 Immunofluorescence staining of rat aorta

2.3 體外高糖鈣化VSMCs鈣化指標檢測及annexin-Ⅵ、IL-1β的表達

與對照組相比，鈣化組細胞有明顯橘紅色結節，茜素紅染色呈陽性(圖4A)，且成骨細胞樣表型標志蛋白BMP-2(圖4B)(P<0.01)及RUNX 2(圖4C～E)(P<0.05，P<0.01)的表達顯著升高。此外，annexin-Ⅵ和IL-1β的表達均上調(圖5)(P<0.01，P<0.05)，且有明顯共定位。

A.Alizarin red staining (scale bar=200 μm); B.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of BMP-2; **P<0.01 compared with the control group; C-E.qPCR (C), Western blot (D), immunofluorescence (E) were used to detect the expression of RUNX 2, scale bar=200 μm; *P<0.05, **P<0.01 compared with the control group圖4 大鼠VSMCs鈣化指標檢測Fig 4 Detection of calcification in rat

A.Western blot was used to detect the expression of annexin-Ⅵ, **P<0.01 compared with the control group; B,C.RT-qPCR was used to detect the expression of annexin-Ⅵ and IL-1β, **P<0.01, *P<0.05 compared with the control group; D.immunofluorescence experiment to detect the expression of annexin-Ⅵ and IL-1β(scale bar=50 μm)圖5 各組大鼠血管平滑肌細胞中annexin-Ⅵ、IL-1β的表達Fig 5 Expression of annexin-Ⅵ and IL-1β in rat

2.4 自噬對鈣化細胞中RUNX 2、annexin-Ⅵ和IL-1β表達的影響

100 nmol/L雷帕霉素處理后，鈣化細胞中促鈣化基因RUNX 2、MVB標志物annexin-Ⅵ和炎性介質IL-1β的表達均降低(P<0.01)。25 μmol/L氯喹對鈣化細胞中RUNX 2的表達無明顯作用，但上調annexin-Ⅵ的表達(P<0.01)(圖6)。

RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of RUNX 2, annexin-Ⅵ and IL-1β in VSMC; *P<0.05, **P<0.01 compared with the control group; #P<0.01 compared with the β-GP group圖6 自噬對鈣化大鼠血管平滑肌細胞中RUNX 2(A)、annexin-Ⅵ(B)及IL-1β(C)表達的影響Fig 6 Effect of autophagy on the expression of RUNX 2 (A), annexin-Ⅵ (B) and IL-1β (C) in calcified rat

3 討論

血管鈣化是T2DM患者死亡的重要危險因素，是一個積極主動的、多因素參與的、可進行生物學調控的生理過程[10]，但關于其發生的確切機制仍需更深入的研究。

MVBs與血管鈣化的發生密切相關。在病理狀態下，血管平滑肌細胞會轉變為合成表型以促進MVBs的分泌，并將靶細胞轉變為鈣化狀態[11]。本研究從動物水平和細胞水平對T2DM血管鈣化中的MVBs進行了研究，發現在T2DM鈣化大鼠主動脈和高糖鈣化細胞中促鈣化基因BMP 2或RUNX-2增加的同時MVBs標志物annexin-Ⅵ的表達也明顯升高。這些結果表明MVBs參與T2DM血管鈣化的發生發展。

血管鈣化的中心環節是VSMC向成骨細胞的表型轉化，而動脈壁炎性細胞的激活及炎性因子的釋放，可以通過促進VSMCs向成骨細胞表型轉化參與血管鈣化的調控[12]。慢性腎臟病大鼠在發生胸主動脈鈣化過程中，VSMC向成骨樣細胞轉分化，促鈣化基因BMP-2增加的同時，IL-1β、IL-6和TNF-α也增加[13]。本研究也發現，在T2DM鈣化中IL-1β的表達明顯升高，且與MVBs標志物Annexin-Ⅵ存在共定位，說明MVBs和IL-1β可能具有協同作用，共同參與生物體內鈣化的形成。

自噬性細胞死亡是MVBs最重要的觸發因素[14]。自噬抑制劑3-MA可以顯著促進高磷誘導的MVBs釋放，加重鈣化程度[15]，因此，自噬可能是血管鈣化的內源性保護機制，通過減少MVBs的釋放，抵消高磷誘導的鈣化[14]。本研究發現在T2DM血管鈣化中，自噬可以調控MVBs的釋放。誘導自噬，MVBs的釋放減少，鈣化程度減輕；而抑制自噬，MVBs的釋放增加，鈣化程度加重。進一步研究發現，誘導自噬還可以降低T2DM血管鈣化中IL-1β的表達。這些結果表明，自噬可能通過調控鈣化細胞MVBs的釋放及炎性介質IL-1β的表達從而影響血管鈣化的進程，但其具體機制仍需進一步研究。

總之，本研究通過體內與體外實驗首次初步驗證了 MVBs和IL-1β具有協同作用，共同參與T2DM血管鈣化的形成；此外，自噬可能通過減少MVBs的釋放，降低IL-1β等炎性因子的表達，從而減輕T2DM主動脈鈣化。這些結果將為進一步探討糖尿病動脈鈣化發生發展中的分子機制提供新的線索，為闡明自噬抑制VC進程的中間機制提供新思路。