食管胃結合部腺癌生物信息學分析及Involucrin基因突變位點篩選

呂 雪，李雪薇，楊 婷，鄭錦秀，祝子鶴，楊 濤,3*，徐 鈞

(山西醫科大學 1.生物化學與分子生物學教研室；2.藥理學教研室；3.細胞生理學教育部重點實驗室，山西 太原030001；4.山西醫科大學第一醫院 肝膽胰外科，山西 太原030001)

食管胃結合部腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction，AEG)是發生于食管-胃交界處的腺癌，表現出與食管癌、胃癌既相關又獨特的臨床病理特征，山西、河北和河南三省交界處是AEG發病率和病死率最高的地區[3]。

食管黏膜上皮基底層的角質細胞通過形成包膜作為防御屏障的基礎， IVL是第一個被發現的包膜前體蛋白[4]，在TGase1的作用下與其他包膜前體蛋白發生交聯[5]。在食管腺癌和巴雷特食管的生物信息分析中，IVL是顯著改變的差異表達基因[6-7]，但目前尚未見IVL異常表達對腫瘤細胞生物學功能影響的研究，IVL突變在AEG中的研究也未見報道。

本文以山西地區AEG患者為研究對象，通過全外顯子組測序、TCGA數據分析IVL的突變情況，并進一步探討IVL異常表達和突變對腫瘤細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系及組織標本：食管癌細胞系KYSE150、KYSE30、TE9 購自ATCC(american type culture collection)，由本實驗室自存。

醫院普通外科切除的22例SiewertⅡ型AEG患者的腫瘤組織及癌旁組織，委托上海華大基因公司運用高通量測序(high-throughput sequencing)技術進行測序，測序深度為200×。

食管癌的基因表達數據來自TCGA數據庫(https://tcga.xenahubs.net/download/TCGA.ESCA. sampleMap/HiSeq_exon.gz)，包含185例腫瘤樣本和11例正常對照樣本，并經Log2標準化(由于目前并無AEG的TCGA表達譜數據和標準化細胞系，TCGA數據庫中AEG患者的IVL突變率為1%，Siewert Ⅱ 型AEG的生物學特性與食管癌更為相近，且IVL在SNU-1、AGS、GES等胃癌細胞中幾乎不表達，所以本文采用的TCGA數據和細胞系皆為食管癌)。

經山西醫科大學第一醫院倫理委員會監督下實施，患者標本采集及檢測全部經知情同意后實施，批準文號：[2020]倫審字(K036)號。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640培養基(含0.4 mmoL/L的Ca2+， Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)(Moregate Biotech公司)；NeofectTMDNA transfection reagent(Neofecth公司)；Ultrapure RNA Kit、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix(Cwbiotech公司)；IVL寡肽(中國常州康龍生物科技有限公司合成)；3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)、G-418(Solarbio公司)；Involucrin抗體(Abcam公司)；Transglutaminase1抗體(Novus公司)；Streptavidin-HRP抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達基因的篩選：由于目前并無AEG的TCGA表達譜數據，且TCGA中AEG數據的IVL突變率為1%，所以本文采用的TCGA數據為食管癌數據。將TCGA數據庫中的196例食管癌樣本分為兩組，一組為15例IVL突變腫瘤樣本和170例非IVL突變腫瘤樣本(T&T組)，一組為15例IVL突變腫瘤樣本和11例正常對照樣本(T&N組)，以Log2FC>1或Log2FC<-1，P<0.05為條件對兩組進行篩選，篩選得到的差異基因輸入Venny網站(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,用韋恩法取交集得到共同差異表達基因。

1.2.2 GO分析和KEGG富集分析：將上述基因的ID統一為Entrez Gene ID輸入到DAVID在線工具(https: //david.ncifcrf.gov/home.jsp)中，選擇Functional Annotation Too作為分析工具進行 GO 分析和 KEGG 信號通路分析，篩選條件為P<0.05。

1.2.3 細胞分組及處理：KYSE150、KYSE30和TE9細胞[8-9]用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養基，在 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，鑒于后期實驗中需要檢測TGase1催化IVL交聯的活性，而TGase1是Ca2+依賴性蛋白，故選用含有0.4 mmoL/L Ca2+的RPMI 1640培養基。

選取對數增殖期的KYSE150、KYSE30、TE9細胞接種于6孔板中，KYSE150分為GV362-NC組和GV362-IVL組；KYSE30和TE9分為shCtrl組、shIVL-1318組、shIVL-1593組、shIVL-1640組、shIVL-2930組。

1.2.4 質粒的構建：IVL過表達質粒GV362-IVL由上海GeneChem公司構建，上游引物為：5′-TACCG GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGTCCCAGCAAC ACACACTGCCAG-3′，下游引物為：5′-TCCTTGTAG TCCATGGATCCTTTATGTTTGGGTGGCCACTGCAC-3′。IVL敲減質粒由上海GenePharma公司構建，靶向IVL的shRNA序列見表1。

表1 靶向IVL的shRNA序列Table 1 shRNA sequence targeting IVL

1.2.5 IVL過表達和IVL敲減質粒轉染及G418的篩選：待細胞匯合至80%～90%時，用NeofectTMDNA transfection reagent分別轉染IVL過表達或敲減質粒，48 h后用G-418(600 μg/mL)篩選穩定轉染細胞株。

1.2.6 RT-qPCR檢測IVLmRNA：使用Ultrapure RNA Kit從細胞中提取總RNA，按照HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix說明進行反轉錄，利用QuantiNova SYBR Green PCR Kit進行qPCR，以GAPDH為內參。引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequences

1.2.7 蛋白質印跡檢測IVL和TGase1蛋白：使用RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液提取細胞總蛋白，BCA法對蛋白進行定量分析。通過SDS-PAGE分離蛋白質，并轉移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜孵育，次日加入二抗室溫孵育1 h，加入ECL發光液曝光顯影。

1.2.8 MTT法檢測細胞增殖：取對數增殖期的KYSE150細胞，按1×103個/孔接種至96孔板中，實驗分為NC組和IVL過表達組，每組設置3個復孔。分別培養0、1、2、3、4和5 d后，每孔加入20 μL(5 g/L)的MTT，4 h后終止培養，棄去培養基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測490 nm處的吸光度值(A)。

1.2.9 劃痕愈合實驗：取對數增殖期的細胞接種于6孔板中，每組設置3個復孔，待細胞完全匯合后用200 μL的槍頭在孔板內行“井”字劃痕，保證每孔劃痕寬度一致。用PBS清洗脫落的細胞后，加入無血清培養基，分別于0 h和12 h時在相同位置拍照觀察劃痕愈合情況。

1.2.10 寡肽合成及體外寡肽與TGase1結合能力分析：為了檢測IVL突變對TGase1催化活性的影響，根據測序結果和TCGA數據庫中IVL的突變情況，合成13種N端標記生物素的IVL寡肽片段(表3)。以pepK5[10]和Net1、Net2(http://genomics.dote.hu/wiki)作為陽性對照，其余10個寡肽為野生型和突變型IVL寡肽分別作為對照組和實驗組。

表3 IVL寡肽片段序列Table 3 IVL oligopeptide fragments sequence

為減少內源性IVL與TGase1結合對實驗的影響，利用shRNA敲減細胞內源IVL；向培養基中另外添加0.3、0.6、0.9 mmoL/L的Ca2+(即終濃度為0.6、1、1.3 mmoL/L)，分別培養2，4，6 d后，提取的裂解液中加入pepK5(終濃度為300 mmoL/L)，37 ℃孵育30 min，進行Western blot分析驗證內源性TGase1的活性；激活細胞中的TGase1后，收集細胞沉淀，提取細胞總蛋白，分成13組，向每組中加入不同的寡肽，終濃度為300 mmoL/L，37 ℃孵育30 min，進行Western blot分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AEG全外顯子組測序和IVL突變的生物信息學分析

對22例山西AEG患者的癌和癌旁組織進行全外顯子組測序，發現突變率位于前5位的基因分別是Tp53、Ttn、Muc16、Nalcn和IVL。IVL的突變率為18%，在4例腫瘤樣本中發生了5處突變(圖1A)，皆為錯義突變。將TCGA數據庫中的196例食管癌樣本分為T&T組和T&N組進行差異基因表達分析(圖1B)。 T&T組篩選出1 707個差異基因，T&N組篩選出4 221個差異基因，使用Venny網站工具取交集，得到777個共同差異表達基因(圖1C)。GO功能分析顯示IVL突變與上皮細胞分化、細胞分化的調控、中性粒細胞趨化和腫瘤壞死因子激活受體的活性等生物學過程有關(圖1D)。KEGG分析表明差異基因富集到細胞因子與細胞因子受體的相互作用、cAMP、TNF等信號通路中(圖1E)。

A.gene mutation analysis of the whole genome sequencing results of cancer tissues and adjacent tissues of 22 AEG patients in Shanxi Province；B.data analysis process of 196 cases of esophageal cancer in TCGA database； C.venn diagram method analysis of the common differentially expressed genes of the T&T group and the T&N group；D,E.GO and KEGG analysis of 777 differential genes圖1 AEG全外顯子組測序及196例食管癌生物信息學分析Fig 1 AEG Whole Exome Sequencing and bioinformatics analysis of 196 cases of esophageal cancer

2.2 過表達IVL抑制食管癌細胞的增殖和遷移

在KYSE150、KYSE30和TE9三種細胞中，KYSE30細胞IVL表達最高，KYSE150的IVL表達最低(圖2A)。將過表達質粒GV362-IVL轉染KYSE150，經過G418篩選得到穩定過表達IVL細胞株，與NC組相比，IVL過表達組在mRNA和蛋白水平明顯上調(圖2B,C)。IVL過表達可抑制食管癌細胞的增殖，上調IVL可抑制劃痕的愈合速度(圖2D,E)。

A.IVL protein expression levels of KYSE150, KYSE30, and TE9 cell lines；B.RNA level of KYSE150； C.protein level of KYSE150 over-expression efficiency; D.MTT test of KYSE150 with IVL over-expression；E.effect of over-expressed IVL on cell migration was verified by scratch healing experiment；*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖2 過表達IVL對食管癌細胞增殖和遷移的影響Fig 2 Effect of over-expression of IVL on the proliferation and migration of esophageal cancer

2.3 IVL重復基序第7位氨基酸的突變可能是其蛋白質功能影響的關鍵因素

3種食管癌細胞中，TE9的TGase1表達水平最高(圖3A)，shIVL-1318可降低TE9細胞內IVL的 mRNA和蛋白水平(圖3B～E)。終濃度1mmoL/L的Ca2+處理TE9細胞4 d后，TGase1活性較好(圖3F)。Q439H突變寡肽與TGase1結合能力明顯比野生型寡肽弱(圖3G)。

A.TGase1 levels in KYSE150, KYSE30 and TE9 cells；B,C.verification of IVL knockdown in KYSE30 cells, RNA level(B), protein level(C)；D,E.effect of SHIVL-1318 plasmid knockdown on TE9 cells was detected, mRNA level(D), protein level(E)；F.detection of TGase1 activity at different Ca2+ concentration treatment for different time；G.detectoin of oligopeptides binding with TGase1；*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖3 野生型IVL寡肽和突變型IVL寡肽與TGase1結合活性的比較Fig 3 Comparison of binding activity of wild-type IVL oligopeptide and mutant IVL oligopeptide with TGase1

3 討論

研究表明AEG在國內外發病率逐年升高[11]，且多數AEG患者發現晚，病死率高[12]。因此，早期診斷對于提高AEG患者預后顯得尤為重要。目前中國AEG的診斷治療方法以采用內鏡活檢和手術為主，除靶向治療及免疫治療相關指標外，仍無一種分子指標或綜合指標可以替代傳統的病理診斷地位[13]。本研究通過對22例山西省AEG患者癌和癌旁組織進行全外顯子組測序并聯合分析TCGA數據，發現山西人群中IVL基因突變率高達18%，而TCGA數據庫中排名前10位的突變基因并無IVL基因突變，這種明顯的差異預示IVL突變有可能是山西AEG特有的發病原因。

IVL作為早期分化標志蛋白，在上皮細胞中的表達增多會促進分化、抑制增殖[14]，這與本文上調IVL后抑制增殖和遷移的結果一致。IVL的蛋白結構中有39個重復序列，重復基序為[LP]-[EKG]-[LHVYQEK]-[PLSQE]-[EQDV]-[QHEKRGA]-Q-[EMVQLP]-[GKLE]-[QHVNLD]。22例食管胃結合部腺癌患者的測序結果和TCGA數據庫食管癌中有24處IVL突變，有23處突變(除了Q72H)分布在重復序列中，Q突變占62.5%，重復序列中第7位氨基酸Q最為保守，且TGase1與IVL結合位點也是Q，綜上推測重復基序第七位Q的突變可能會影響IVL功能。因此，針對23處突變中有5個發生在重復基序第7位氨基酸的突變設計了10個野生寡肽和突變寡肽去驗證這種突變是否會影響與TGase1的結合能力。結果表明突變的Q439H寡肽與TGase1結合能力減弱，證實該突變可能無法通過TGase1參與角質包膜的形成；Q239P寡肽雖然與TGase1結合能力幾乎不變， 但是和其他包膜前體蛋白結合能力減弱(IVL還與FLG、LOR、RPPL、SPRR1A等包膜前體蛋白結合[10, 15])。由于這些寡肽并無蛋白質的高級結構，具有完整結構的突變IVL是否與突變的寡肽一樣，通過減弱與TGase1或其他包膜前體蛋白結合從而導致角質包膜形成障礙，還需要進一步研究。

本研究發現,山西地區食管胃結合部腺癌患者IVL突變率高達18%，過表達IVL可抑制食管癌細胞中的增殖和遷移，IVL Q439H突變可能影響其與TGase1結合，以上結果為探索山西地區食管胃結合部腺癌的發病機制提供了一種新的參考。