醋酸潑尼松對糖尿病腎病模型大鼠腎功能、腎臟炎性反應及AMPK/SIRT1信號通路的影響

鄧九紅，鄭 超，王聲遙，王心怡

(1.溫州醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院， 浙江 溫州 325035； 2.平陽縣第二人民醫(yī)院 內分泌科，浙江 平陽 325405)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重微血管病變之一，約占糖尿病患者的40%，也是導致終末期腎臟疾病的主要原因[1-2]。DN的病因復雜，腎臟炎性反應在促進DN的發(fā)展進程中至關重要[3]。目前，臨床仍缺乏有效的藥物來預防和治療DN。醋酸潑尼松是腎上腺皮質激素類藥，具有顯著的抗炎作用，主要用于過敏性與自身免疫性炎性疾病[4]。近年來，醋酸潑尼松片治療狼瘡性腎炎[5]、腎病綜合征[6]、特發(fā)性膜性腎病[7]療效確切，可有效減輕病情程度，說明醋酸潑尼松片可減輕腎臟炎性反應，但其對DN是否具有藥理活性卻鮮有報道。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)信號通路是重要的能量傳感信號傳導途徑，在糖尿病中具有調控作用[3]；AMPK失活和SIRT1水平降低與DN的進展有關，激活AMPK和SIRT1對降低氧化應激和炎性反應，保護DN小鼠腎損傷，降低蛋白尿有重要作用[8]。因此，本研究擬采用DN大鼠模型，探究醋酸潑尼松對DN大鼠腎臟炎性反應的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD雄性大鼠70只，6～8周齡，體質量(200±20)g[溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK(浙)2019-0009]。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2 主要藥品、試劑：醋酸潑尼松片(天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，規(guī)格：5 mg)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司)；AMPK抑制劑compound C(CC，TargetMo公司)；空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、尿微量白蛋白(urine microalbumin，U-mAlb)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑、高碘酸-希夫(periodate schiff，PAS)染色試劑、放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(碧云天生物科技公司)；兔源AMPK、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、SIRT1、乙酰化核因子-κB p65(acetylated nuclear factor-κB p65，ac-NF-κB p65)、核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65，NF-κB p65)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、β-肌動蛋白(β-actin)一抗和山羊抗兔二抗(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為對照組，喂以普通飼料。其余大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周聯(lián)合1次性腹腔注射STZ(55 mg/kg)成功制備DN模型[9]。模型判斷標準：連續(xù)3 d大鼠FBG>16.7 mmol/L，且出現典型的“三多一少”(即多食多飲多尿，體質量減少)表現，連續(xù)3次U-mAlb>15 μg/mL，且病理學檢查發(fā)現腎組織出現明顯病變(表現為腎小管管腔變大，腎小球體積變小，系膜細胞增生，基底膜增厚，大量炎性細胞浸潤)。成功造模48只大鼠，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、醋酸潑尼松低(6.25 mg/kg)、高(12.5 mg/kg)劑量組、醋酸潑尼松+CC組(醋酸潑尼松12.5 mg/kg+compound C 0.2 mg/kg)[10]，每組12只。分組完成后于給藥前收集大鼠24 h尿液檢測了U-mAlb水平，并通過尾末梢采血檢測了FBG水平以及經過眼眶靜脈叢取血檢測了血清SCr、BUN水平，結果顯示模型大鼠U-mAlb、FBG、SCr、BUN水平均較對照組顯著升高(P<0.05)，說明分組均勻。

分組完成后，醋酸潑尼松各劑量組分別給予相應劑量的醋酸潑尼松灌胃，醋酸潑尼松+CC組大鼠在給予醋酸潑尼松灌胃的同時腹腔注射0.2 mg/kg的compound C，對照組和模型組灌胃等量的蒸餾水，1次/d，灌胃體積10 mL/kg，共給藥4周。醋酸潑尼松給藥劑量根據其臨床劑量(60 kg成人給藥劑量60 mg/d)，按種屬間體表面積換算，大鼠對應給藥劑量為成人的6.25倍，換算大鼠等效劑量為6.25 mg/kg，因此，設置醋酸潑尼松低、高劑量為6.25、12.5 mg/kg。

1.2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察及FBG、24 h U-mAlb的檢測：實驗過程中觀察大鼠的毛色、飲食飲水量、尿量、體質量等一般狀態(tài)；采集尾末梢全血，檢測給藥結束后大鼠FBG水平；并在給藥結束后通過代謝籠收集大鼠24 h尿液，檢測大鼠尿液24 h U-mAlb含量。

1.2.3 大鼠血清SCr、BUN和炎性因子水平的檢測：實驗結束時，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，打開腹腔，腹主動脈取血，分離血清，檢測大鼠血清SCr、BUN、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.4 腎臟組織病理形態(tài)學變化的檢測：取大鼠右側腎組織，于4%多聚甲醛中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進行HE和PAS染色，觀察腎臟病理學變化。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測腎組織AMPK/SIRT1信號通路相關蛋白的表達：取大鼠部分腎組織，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿，以20 000 r/min的速度在4 ℃離心10 min。取上清，BCA法進行蛋白定量，RIPA平衡蛋白濃度后加熱變性，然后取等量蛋白樣品上樣(30 μg)，凝膠電泳分離，濕轉法轉膜，5%脫脂奶封閉膜1 h，隨后在4 ℃下與一抗(AMPK、p-AMPK、SIRT1、ac-NF-κB p65、NF-κB p65、MCP-1、β-actin，按1∶1 000的比例稀釋；β-actin按1∶2 000的比例稀釋)孵育過夜，第2天加入二抗室溫下孵育2 h，洗去二抗，ECL顯色，以β-actin為內參，分析膜上蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

對照組大鼠精神良好，活躍度高，毛色有光澤，飲食正常，墊料干燥；模型組大鼠出現不同程度的精神萎靡，活動減少，毛色發(fā)黃無光澤，進食和飲水量明顯增多，尿量也增多，墊料潮濕，大便糖稀狀；給藥結束后，醋酸潑尼松低、高劑量組大鼠上述癥狀較模型組大鼠明顯好轉，而醋酸潑尼松+CC組大鼠一般狀態(tài)較醋酸潑尼松高劑量組有加重趨勢。

2.2 各組大鼠FBG和腎功能指標的變化

與對照組相比，模型組大鼠FBG、24 h U-mAlb、血清SCr、BUN水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醋酸潑尼松低、高劑量組大鼠FBG、24 h U-mAlb、血清SCr、BUN水平顯著降低(P<0.05)；與醋酸潑尼松高劑量組相比，醋酸潑尼松+CC組大鼠上述指標顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠FBG和腎功能指標的比較Table 1 Comparison of FBG and renal function indexes of rats in each group n=12)

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平

與對照組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醋酸潑尼松低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；與醋酸潑尼松高劑量組相比，醋酸潑尼松+CC組大鼠上述指標顯著升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較Table 2 Comparison of serum inflammatory factor levels of rats in each pg/mL, n=12)

2.4 各組大鼠腎組織病理學變化

對照組大鼠腎組織染色均勻，結構清晰，腎小球、腎小管形態(tài)正常，腎小管上皮細胞排列整齊，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠腎小管-腎間質出現局灶性病變，腎小管管腔變大，空泡化明顯，胞質染色變淺，腎小球體積變小，腎小管上皮細胞核固縮，大量炎性細胞浸潤，腎小球系膜細胞增生，系膜區(qū)擴大，基底膜增厚；醋酸潑尼松低、高劑量組大鼠上述腎臟病變情況明顯改善，炎性細胞浸潤、系膜細胞和基質增生減輕，腎小管擴張數量減少，且醋酸潑尼松高劑量組改善效果較優(yōu)；而醋酸潑尼松+CC組大鼠腎臟病變較醋酸潑尼松高劑量組有加重趨勢(圖1)。

A.control group; B.model group; C.prednisone acetate low dose group; D.prednisone acetate high dose group; E.prednisone acetate+CC group圖1 各組大鼠腎組織病理學變化Fig 1 Renal histopathological changes of rats in each group (HE and PAS staining)

2.5 各組大鼠腎組織AMPK/SIRT1信號通路相關蛋白表達

與對照組相比，模型組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達顯著降低，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醋酸潑尼松低、高劑量組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達顯著升高，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與醋酸潑尼松高劑量組相比，醋酸潑尼松+CC組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達顯著降低，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖2，表3)。

1.control group; 2.model group; 3.prednisone acetate low dose group; 4.prednisone acetate high dose group; 5.prednisone acetate+CC group圖2 各組大鼠腎組織AMPK/SIRT1信號通路相關蛋白的表達Fig 2 Expression of AMPK/SIRT1 pathway related proteins in renal tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腎組織AMPK/SIRT1信號通路相關蛋白表達比較Table 3 Comparison of AMPK/SIRT1 signal pathway related protein expression in renal tissue of rats in each group n=12)

3 討論

糖尿病產生的高血糖狀態(tài)會刺激趨化因子的產生，隨后介導白細胞進入腎組織產生炎性反應，促進DN的發(fā)生發(fā)展，因此靶向炎性反應是防治DN發(fā)展的有效途徑[11]。

高血糖可以觸發(fā)NF-κB，NF-κB p65活化進入細胞核后可激活轉錄，誘導下游多種細胞因子的轉錄，如MCP-1、TNF-α和白介素系統(tǒng)(IL-6、IL-1β)[12]。醋酸潑尼松是強效的免疫抑制劑和抗炎藥，被廣泛用于過敏性與自身免疫性炎性疾病的治療[4]；其對腎炎具有顯著的改善作用，可有效改善腎病綜合征患者腎功能、血脂水平，并降低尿蛋白含量[5-7]。在本次研究中，采用高糖高脂飼料聯(lián)合STZ腹腔注射成功建立DN大鼠模型，腎功能損傷嚴重；而醋酸潑尼松干預后可明顯減輕DN大鼠的腎功能損傷，使大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1蛋白水平降低。

AMPK是一種對能量高度敏感的絲氨酸/蘇氨酸激酶，與糖尿病密切相關[13]。SIRT1是AMPK的下游效應分子，是一種依賴NAD+的脫乙酰酶，它通過使目標分子脫乙酰化而激發(fā)轉錄因子的抑制活性，抑制與炎性有關的基因的轉錄，參與炎性反應的調節(jié)。研究表明，NF-κB p65亞單位上310位賴氨酸(Lys)的乙酰化修飾水平與NF-κB的活性有明顯的正相關性[14]。AMPK磷酸化后可激活SIRT1，而SIRT1可將p65蛋白的Lys310位點去乙酰化，減弱NF-κB p65的轉錄激活能力[15]。本研究結果顯示，DN大鼠腎組織中AMPK/SIRT1通路失活。經醋酸潑尼松干預后，腎組織p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達升高，ac-NF-κB p65/NF-κB p65和MCP-1蛋白表達降低；說明AMPK/SIRT1通路被激活；而AMPK抑制劑compound C可明顯減弱醋酸潑尼松對AMPK/SIRT1通路的激活作用；提示，醋酸潑尼松可能通過激活AMPK/SIRT1通路，抑制NF-κB活化。

綜上所述，醋酸潑尼松可減輕DN大鼠腎臟炎性反應，保護腎功能，其作用機制可能與激活AMPK/SIRT1通路，進而抑制NF-κB的激活有關。本研究僅從炎性反應的角度探究了醋酸潑尼松對DN的保護機制，然而，在DN中，除炎性反應外，其他機制(如氧化應激和自噬)與腎功能損傷密切相關，醋酸潑尼松能否通過影響氧化應激或自噬保護腎功能，有待進一步研究。