miR-30b促進彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞凋亡

許巧玲，應江山，崔 冉，張 寧

(上海市閔行區腫瘤醫院(復旦大學附屬腫瘤醫院閔行分院)腫瘤內科，上海 200240)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)多發生在中老年人群，其侵襲能力較強、細胞繁殖速度較快[1]。患者常見的臨床表現為身體多處產生無痛性的腫塊、體質量下降、盜汗等[2]。彌漫性大B細胞淋巴瘤可產生于機體的各部位，是由惰性的淋巴瘤轉化而形成，是一種具有高度異質性疾病，其發病誘因可能是BCL6、BCL2以及MYC的重排，最終導致生發中心細胞或B細胞起源的惡性具有克隆性質的轉化和擴散。對于彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療常規采用化學治療的方法，但此種治療方法會使病情在一段時間之內反復發作，且預后較差，給患者帶來較大的生活困擾，因此對于彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療需要尋找新的方法。有研究指出，失調的miRNA的表達參與多種疾病的產生與發展，尤其是惡性腫瘤[3]。根據多位研究者研究顯示，miR-30b與腫瘤發生發展密切相關，且其在多種腫瘤中也呈現為低表達，但其在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的作用機制目前尚無定論[4-5]。脆性組氨酸三聯體(fragile histidine triad gene，FHIT)是一種抑癌基因，對于調控細胞周期也有一定的作用，FHIT在白血病的研究較多，FHIT表達與白血病疾病進展呈現負相關[6]，目前，關于miR-30b、FHIT及DLBCL的相關性研究較少，因此，本文通過轉染miR-30b到DLBCL細胞中，探究miR-30b與FHIT對彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本及細胞：DLBCL細胞系(上海熹垣生物科技有限公司)，選取上海市閔行區腫瘤醫院(2017年2月至2019年6月)DLBCL患者的腫瘤石蠟標本與同期淋巴結正常組織石蠟標本共42例作為研究對象，其中DLBCL組21例、對照組21例。DLBCL患者男、女各占50%，平均年齡(54.5±7.4)歲，淋巴結正常組織男12例、女8例，平均年齡(55.3±6.9)歲。DLBCL患者均已確診且兩組患者及家屬均知情并已詳細了解本次實驗內容。已通過上海市閔行區腫瘤醫院倫理委員會審批(批號：201805-003)。

1.1.2 試劑：胎牛血清(廣州濟恒醫藥有限公司)；FHIT試劑盒(上虞艾科儀器設備有限公司)；乙醇(濟南坤豐化工有限公司)；PCR引物序列(上海聯邁生物工程有限公司)；胰蛋白酶(杭州浦泰生物科技有限公司)；RPMI 1640培養液(青島雅各化學試劑銷售有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：運用RPMI 1640培養液(含胎牛血清)，于37 ℃，5% CO2條件下培養，取對數期細胞進行試驗。miR-30b的轉染：將細胞接種于無血清培養液的6孔板中培養。直至細胞增殖至45%～55%匯合時，按說明書操作，用Lipofectamine2000TM轉染50 nmol/L相應的miR-30b mimics、miR-30b-NC，充分混合，轉染9 h后，繼續培養3 d后即可進行實驗。實驗分為3組WW組(DLBCL無轉染組)、WZ組(DLBCL轉染NC組)、ZR組(DLBCL轉染miR-30b 組)。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-30b的表達：用胰蛋白酶消化后提取細胞懸液，沖洗，放于無菌試管中，采用Trizol試劑提取RNA，反轉錄為mRNA后進行擴增，以β-ation為內參，PCR反應條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，94 ℃ 5 min，72 ℃ 3 min，72 ℃ 5 min，總計55個循環(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 Western blot檢測FHIT的表達:細胞中加入 600 μL裂解液進行裂解并提取蛋白,并對蛋白的濃度進行測量,分裝后,保存在-20 ℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均,按照4∶1的比例進行,然后將其煮沸、變性。把電泳后的50 μg蛋白樣品轉移到PVDF膜上,加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后PBS漂洗3次，每次間隔10 min,最后加入二抗對溶液稀釋,常溫封閉1 h。取出PVDF膜,用上述方法漂洗，DAB顯色后照相。

1.2.4 比色法檢測caspase-3活性: 將細胞接種在96孔板中培養。向各孔中加入50 μL 2×Rwaction緩沖液，后加入50 μL細胞裂解液，混勻后在各測定孔中加入底物工作液5 μL，在各空白孔中加入1×Rwaction緩沖液5 μL，混勻，避光放于37 ℃水浴1.5 h，結束后運用酶標儀檢測吸光度值(A值)。

1.2.5 流式細胞儀檢測DLBCL細胞凋亡:收集DLBCL細胞(2×105個/孔)接種于6孔板中，胰蛋白酶消化細胞，完全培養基終止；PBS清洗，進行細胞計數，1 250 r/min，離心6 min，棄上清， 混入500 μL結合緩沖液重懸。加入 5 μL annexin V-FITC混勻、 10 μL PI混勻，室溫避光孵育5～15 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞侵襲:將DLBCL細胞按照5×103個/孔種植于96孔板中，8孔×5板/組。將50 mg/L的基質膠稀釋后加入小室上層，37 ℃下呈凝膠狀態，細胞1×105個/mL，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養基，37.5 ℃，培養2 d，取出培養基，拭去殘留細胞，現配結晶紫，每孔500 μL，將小室放入，25 ℃染色30 min，PBS清洗1次，稍晾干。顯微鏡觀察每個樣本連續選5個清晰視野進行數量統計，然后計算平均數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RT-PCR檢測miR-30b的表達結果

DLBCL組miR-30b表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，由此可看出miR-30在彌漫性大B淋巴細胞瘤組織中為低表達。ZR組中miR-30b的表達水平高于WW組、WZ組(P<0.05)，表明轉染成功(圖1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with WW and WZ group圖1 miR-30b在組織與細胞中的表達Fig 1 Expression of miR-30b in tissues and cells

2.2 Western blot檢測FHIT的表達

DLBCL組FHIT表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。ZR組中FHIT蛋白表達水平高于WW組、WZ組(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with WW and WZ group圖2 FHIT在組織與細胞中的表達Fig 2 Expression of FHIT in tissues and cells

2.3 Caspase-3活性的檢測結果

在WW組DLBCL細胞中caspase3活性與WZ組相似，ZR組DLBCL細胞中caspase3活性較WW組、WZ組明顯增高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with WW and WZ group圖3 各組DLBCL細胞中caspase-3活性比較Fig 3 Comparison of caspase-3 activity in DLBCL cells in each group

2.4 DLBCL細胞凋亡情況的檢測結果

24、48和72 h時WW組、WZ組DLBCL細胞凋亡率接近，ZR組細胞凋亡率高于WW組、WZ組(P<0.05)，且隨著時間的延長各組細胞凋亡率隨之增高(表2，圖4)。

圖4 培養72 h各組DLBCL細胞凋亡情況Fig 4 Apoptosis of DLBCL cells in each group after 72 hours of culture

表2 各組細胞不同時間凋亡率比較Table 2 Comparison of the apoptosis rate of cells in each group at different time

2.5 Transwell小室法檢測細胞侵襲結果

WW組與WZ組DLBCL細胞侵襲數量分別為(157±15)個、(156±15)個，ZR組DLBCL細胞侵襲數量(85±9)明顯低于WW組、WZ組(P<0.05)(圖5)。

圖5 各組DLBCL細胞侵襲情況Fig 5 Invasion of DLBCL cells in each group

3 討論

DLBCL是一種血液系統的侵襲性淋巴瘤[7]，目前該病多采用免疫靶向以及化學治療，但患者預后達不到理想效果。miRNA在細胞的生物過程中起著調控的作用，且與多種腫瘤細胞的發生與發展有著密切的關系，發揮著抑癌或致癌的作用[8]。miR-30b運用轉錄調節功能調控蛋白的表達，使下游靶基因受其調控發揮效應，從而調控細胞的生物學行為[9]。miR-30b在肺癌細胞中的表達較低，通過轉染miR-30b后其表達升高，且轉染后彌漫性大B淋巴瘤細胞的侵襲能力有效降低，促使其凋亡[10]。本實驗結果與上述結果相似，顯示miR-30b在DLBCL中低于正常組織，并隨著時間的延長ZR組癌細胞的凋亡數量逐漸增加，說明mir-30b過表達可抑制DLBCL細胞侵襲，從而促進其凋亡。

FHIT是一種轉錄基因，其滅活性質可能是由于癌癥作用于FHIT中的p53基因，致癌因子通過調控p53基因從而導致FHIT外顯子缺失，同時增加了FHIT的降解，并造成FHIT基因堿基的活性出現關閉現象[11]。FHIT蛋白抑制腫瘤細胞的產生與發展是通過調節并控制腫瘤細胞的周期以及加速腫瘤細胞凋亡從而達到抑制目的。本文研究發現FHIT在DLBCL中低于正常組織，在ZR組中升高。研究表明，在肺癌、胃癌、乳腺等腫瘤組織中存在FHIT的表達失衡。 宮頸癌中FHIT的水平低于正常宮頸組織，可能與致癌因子使FHIT在宮頸癌中發生了缺失有關[12]。低表達的miR-182-5p通過促進FHIT的表達從而抑制喉鱗癌細胞的發展[13]。本文研究結果與其上述研究結果相似，說明mir-30b抑制DLBCL細胞生物活性可能與調控FHIT蛋白有顯著關系。

Caspase-3是細胞凋亡中的一個環節，絕大部分引發細胞凋亡的因素都是經過caspase-3介導的,其作用機制是調控細胞凋亡抑制物并使相關修復因子加速裂解進而達到促進細胞凋亡的作用[14]。Caspase-3在DLBCL中低表達，且與DLBCL臨床預后有顯著關系[25]。本研究結果顯示，DLBCL細胞轉染miR-30b 后其caspase3活性較其他兩組明顯增高，說明，過表達miR-30b可提高彌漫性大B細胞淋巴瘤轉染細胞中caspase-3的活性，對腫瘤細胞凋亡有正促進作用。

綜上所述，經過轉染miR-30b后彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的凋亡增加、侵襲數量減少，其作用機制可能與過表達miR-30b促進FHIT蛋白表達及caspase-3活性有關。