華蟾素聯合阿霉素對腦膠質瘤細胞增殖、體外侵襲能力的影響及機制研究

李亞明，張智峰，劉 霞

(1.鄭州大學第一附屬醫院神經外科,河南 鄭州450052；2.徐州市第一人民醫院病理科，江蘇 徐州221600)

當前，惡性腫瘤已躍居危害人類健康疾病的榜首，很多腫瘤患者就診時已處于中晚期，手術加放化療是治療首選，如何減弱化療藥物的不良反應，提高患者以后生存質量是亟待解決的重點，前期實驗中我們發現華蟾素(Cinobufacin)聯合阿霉素(Dox)對腦膠質瘤治療具有可行性，兩者聯合可提高腦膠質瘤U251細胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表達，加速腦膠質瘤U251細胞的凋亡。華蟾素不僅可直接作用腫瘤細胞，還可提高阿霉素對腦膠質瘤U251細胞的敏感性及抗腫瘤的效用，且減弱阿霉素的不良反應。華蟾素聯合阿霉素作用腦膠質瘤U251細胞對其增殖和體外侵襲能力影響如何？本實驗繼續深入研究。腫瘤患者死亡的最主要因素之一是腫瘤侵襲、轉移導致的，樁蛋白(Paxillin)基因是致瘤性酪氨酸激酶的一種底物，具有調節細胞移動和播散等功能，進而能夠提高腫瘤細胞轉移、侵襲的能力[1-2]。多項研究報道Paxillin參與動態調節黏著斑、是一種重要的細胞黏附因子，可調節細胞的移動、誘導細胞惡性轉化和播散[3-5]。腫瘤的浸潤轉移和預后與細胞的黏附力、移動力的改變密切相關，這提示Paxillin在腫瘤細胞的浸潤、轉移中起著關鍵作用[6-8]。本研究探討華蟾素聯合阿霉素能否降低Paxillin基因在腦膠質瘤U251細胞中的表達，以觀察Paxillin基因表達下調后腦膠質瘤U251細胞體外侵襲能力的變化，同時檢測各個作用組腦膠質瘤U251細胞中局部黏附斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)及基質金屬蛋白酶2(Matrix metallo proteinases-2,MMP-2)基因、蛋白的表達水平的差異，為腦膠質細胞瘤侵襲機制的研究提供新的思路，并為其臨床分子靶向治療提供實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腦膠質瘤U251細胞株由鄭州大學病理教研室提供，培養在含RPMI-1640的培養液中(37 ℃、5% CO2、10%胎牛血清，100 mg/ml鏈霉素、青霉素)常規傳代觀察培養。阿霉素和華蟾素注射粉劑(R034347-25，Z34020273)、胎牛血清、RPMI-1640、ECL顯色試劑盒、 兔抗人Paxillin、FAK和MMP-2抗體均購自美國Santa Cruz公司

1.2 實驗方法

1.2.1 各組細胞組織形態觀察：先用胰酶消化處理腦膠質瘤U251細胞成3×104/ml的單細胞懸液，再分成四組，均接種在96孔板上。阿霉素組：每孔依次滴加0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素(各濃度均設6個復孔)；華蟾素組：每孔依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml的華蟾素(各濃度均設6個復孔)；聯合組：每孔依次滴加0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和 10.00 μg/ml的華蟾素(各濃度均設6個復孔)；對照組：每孔依次滴加上述分組同劑量的RPMI-1640培養液作用腦膠質瘤U251細胞。將上述分組細胞置入37 ℃、5% CO2的培養箱培養48 h后棄上清液取出96孔板中的蓋玻片，放至倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況、形態學變化。

1.2.2 各組細胞增殖抑制率檢測：將分組的細胞培養24、48、72 h后加入MTT 20.00 μl(5.00 mg/ml)，繼續培養4 h后終止并棄掉上清液，加入DMSO 200 μl/孔振蕩搖勻10 min后上調節酶標儀檢測，計算波長570 nm(空白對照組調零)比色下的OD值，檢測藥物半數抑制濃度(IC50)和細胞增殖抑制率。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]3。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100% 。

1.2.3 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)：按照Trizol試劑盒步驟提取各組總的RNA。先反轉錄反應合成cDNA第一鏈后再行PCR反應(β-actin為內參)，Paxillin(383 bp) mRNA引物序列為F：5’-TGAAACTGGAACCCTTGTCC-3’，R：5’ TATGCTGGCA TTGTCTGGAG-3’；FAK(498 bp) mRNA引物序列為F：5’-TCCTAATGTTGATGCCTGCC-3’，R:5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3；MMP-2 (607 bp) mRNA引物序列為F：5’-ATCCAGACTTCCTC AGGCG-3’，R：5’-GTAGTTGGCCACATCTGGGT-3’；β-actin(170 bp) mRNA引物序列為，F：5’AAATCTGGCACCACACCTT-3’，R：5’-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3’。按照RT-PCR試劑盒說明逐步操作，PCR反應條件和步驟：96 ℃預變性6 min；96 ℃ 35 s，退火條件Paxillin (58 ℃、50 s)、FAK (58 ℃、48 s)、MMP-2 (60 ℃、 48 s)，三個基因在74 ℃延伸1.5 min，30個循環。取10 μl產物在1%瓊脂糖凝膠電泳成像后分析其條帶峰面積來反映Paxillin、FAK、MMP-2 中RNA表達的改變。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)：收集提取各組細胞總蛋白量，用Bradford 法測定蛋白質濃度后，取50 μg蛋白上樣量，通過8%、12% SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本，再轉至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉后加入兔抗人Paxillin抗體(1∶300)、FAK抗體(1∶300)、MMP-2 抗體(1∶200)，放置4 ℃濕盒內孵育過夜；隔日先用TBS洗膜(10 min×3次)，再加入羊抗兔二抗，繼續室溫微搖2 h，再次TBS洗膜(10 min×3次)；X線膠片曝光顯影，β-actin抗體作為內參上樣對照，采用Gel-Doc圖像分析系統測定各條帶灰度值，反映Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達變化。

1.2.5 侵襲小室(Boyden chamber)實驗：腦膠質瘤U251細胞遷移、侵襲能力檢測采用Boyden chamber小室觀察分析。具體步驟如下：將各組細胞(每組大約105個細胞)懸浮在有0.2%的小牛血清的600 μl的培養液中，依次接種在Boyden小室的上層，培養6 h后收集遷移至濾膜下層的細胞，先用4%多聚甲醛固定后再用0.1%結晶紫染色(細胞“貼壁”面朝上，蓋載玻片)，放置顯微鏡下隨機計數濾膜下層的細胞個數，至少選取5個高倍(×400)視野內的穿膜細胞數，計算平均值。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 見表1。腦膠質瘤U251細胞在不同濃度的阿霉素作用24、48、72 h后，各組細胞增殖抑制率對比差異有統計學意義(均P<0.05)，相關分析發現在阿霉素濃度0～2.00 ng/ml的范圍，腦膠質瘤U251細胞增殖抑制率與其濃度無明顯相關性(r=0.227,P>0.05)。單用阿霉素干預腦膠質瘤U251細胞24、48、72 h，IC50> 2.00 ng/ml，提示腦膠質瘤U251細胞對阿霉素作用不敏感。故采用2.00 ng/ml阿霉素完成后續實驗；不同濃度的華蟾素干預腦膠質瘤U251細胞24、48、72 h后，各組增殖率比較差異有統計學意義(均P<0.05)，相關分析顯示華蟾素濃度在0～25.00 μg/ml范圍，腦膠質瘤U251細胞增殖抑制率與華蟾素濃度關系呈負相關(r=-0.735，P<0.05)，提示腦膠質瘤U251細胞對華蟾素作用敏感，故選用10.00 μg/ml 華蟾素完成后續實驗；聯合組與其他各組比較，細胞增殖抑制率明顯加強且表現一定的劑量依賴性。

表1 四組干預不同時間腦膠質瘤U251細胞增殖抑制率比較(%)

2.2 不同干預下腦膠質瘤U251細胞形態變化差異 見圖1。未干預的腦膠質瘤U251細胞光鏡下呈多邊形、少圓形、梭形狀貼壁生長，細胞膜邊緣光整，細胞間排列結構緊密，易有核分裂，偶見壞死細胞，整個細胞多以彌漫均勻單層排列狀。而加入華蟾素組、阿霉素組、聯合組的細胞顯示：少數細胞胞膜皺縮，細胞變圓，間隙變寬，且單個細胞體積變小，形態狹長，細胞連接松散，核分裂和壞死細胞增多，整體細胞數量減少，以聯合組的效果最明顯，藥物組與對照組比較，細胞的生長活力均顯示不同程度地被抑制。

2.3 不同干預下腦膠質瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表達情況 見表2。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml 華蟾素聯合作用，結果顯示與對照組相比，阿霉素組、華蟾素組、聯合組Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達量均顯著減少(均P<0.05)。聯合組與阿霉素組、華蟾素組的Paxillin、FAK、MMP-2表達量比較，差異具有統計學意義(均P<0.05)。

表2 不同干預下腦膠質瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表達

2.4 不同干預下腦膠質瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表達情況 見表3。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml 華蟾素聯合作用，結果顯示對照組相比，阿霉素組、華蟾素組、聯合組Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表達量均顯著減少(均P<0.05)。聯合組與阿霉素組、華蟾素組的Paxillin、FAK、MMP-2表達量比較，差異具有統計學意義(均P<0.05)。

A:對照組;B:2.00 ng/ml 阿霉素組;C:10.00 μg/ml 華蟾素組;D:2.00 ng/ml 阿霉素+10.00 μg/ml華蟾素組

表3 不同干預下腦膠質瘤U251細胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表達

2.5 不同干預下腦膠質瘤U251細胞侵襲能力差異 見表4(圖2)。各組作用48 h后，收取各組細胞，接種在小室的上層。選取2.00 ng/ml阿霉素與10.00 μg/ml華蟾素聯合作用，結果顯示與對照組比較，華蟾素組、阿霉素組及聯合組穿模細胞數均下降，聯合組的細胞的穿膜數下降最明顯(均P<0.05)，華蟾素組與阿霉素組相對比較顯示無統計學意義(P>0.05)。Boyden chamber結果提示，聯合組可以顯著抑制腦膠質瘤U251細胞的侵襲、遷移能力。

表4 不同干預下腦膠質瘤U251細胞的侵襲能力(%)

A:對照組;B:2.00 ng/ml 阿霉素組;C:10.00 μg/ml華蟾素組;D:2.00 g/ml阿霉素+10.00 μg/ml華蟾素組

3 討 論

最新發布的中國惡性腫瘤流行病學數據顯示，惡性腫瘤的發病率逐年增長，嚴重危害人類健康和生活。目前，晚期惡性腫瘤的治療仍以手術治療為主，術后化學治療為輔，而化療藥物自身的不良反應，導致臨床治療效果不盡人意，且嚴重影響患者術后生活質量。前期實驗中我們發現華蟾素可以抑制腫瘤細胞，提升患者免疫功能，且與阿霉素聯合可通過提高腦膠質瘤U251細胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表達，來增強腦膠質瘤U251細胞的凋亡，提高阿霉素的療效[9-10]。阿霉素作為化療藥物在臨床治療中會產生不良反應，但研究已經證實，合理恰當的濃度具有抗腫瘤功效。華蟾素因其能抑制腫瘤細胞生長、鮮有不良反應已被臨床認可且推薦應用。四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)結果證實華蟾素和阿霉素具有交互作用，阿霉素可以抑制腦膠質瘤U251細胞的增殖但效果不明顯，阿霉素與華蟾素聯合作用腦膠質瘤U251細胞，對其增殖抑制作用優于各單藥作用組，且與藥物濃度、干預時間呈現正相關性。前期實驗也證實了華蟾素與低劑量阿霉素聯合作用不僅提高阿霉素對腦膠質瘤U251細胞的敏感性且降低了阿霉素自身的不良反應。阿霉素單藥作用對腦膠質瘤U251細胞的增殖抑制效應明顯弱于華蟾素單藥組。藥理機制可能是阿霉素對腦膠質瘤U251細胞靈敏度低于華蟾素，因此本實驗為了增加阿霉素的敏感度同時減弱其不良反應，并且保持其現有的實驗效應，我們選用將阿霉素與華蟾素聯合，發現其作用效應仍強于各單藥作用，推測阿霉素聯合華蟾素對腦膠質瘤U251細胞的作用可能是通過調控某些相關的基因表達來發揮效應。Paxillin基因定位在人染色體12q24，是LIM家族蛋白成員，分布在黏著斑，更是重要的細胞黏附因子之一。它能夠與整合素關聯，可與BCR-AB2、v-Src、v-Crk等致瘤性蛋白結合，促使致瘤性酪氨酸激酶活化，是構成細胞與細胞外基質局部黏附的關鍵通路。Paxillin能調節細胞移動、散播，擾亂或誤導控制細胞增殖所需的生長因子信號級聯的傳遞，改變腫瘤細胞運動黏附的信號傳導，進而提高腫瘤細胞轉移、侵襲的能力[11-14]。目前許多研究[7，15]已證實，肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中Paxillin呈高表達，且高表達的Paxillin加強了腫瘤細胞與周圍非腫瘤細胞之間的局部黏附作用，使腫瘤細胞更易發生浸潤、遷移進而形成轉移。我們在前期實驗中發現腦膠質細胞瘤中也存在Paxillin基因的高表達,且Paxillin的表達水平與腦膠質細胞瘤的分化程度、淋巴結轉移及侵襲性呈正相關。故本課題采用華蟾素聯合阿霉素作用腦膠質瘤U251細胞，研究能否對細胞黏附相關蛋白FAK和與侵襲轉移有關的基因MMP-2表達產生作用進而影響Paxillin基因的表達來影響腦膠質瘤U251細胞的侵襲轉移。基質金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMPs)是細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的重要蛋白水解酶，是降解人體內細胞外基質的主要酶類，對于腫瘤細胞轉移突破物理屏障及促使腫瘤克隆增殖，加促新生血管的形成有重要意義[16-19]。MMPs是FAK信號傳導通路的下游分子，因其幾乎能降解細胞外基質的所有成分而備受研究者青睞[20-21]。在本實驗中，我們首先將腦膠質瘤U251細胞株消化處理成3×104/ml的懸液，分為四組。阿霉素組分別加入0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素；華蟾素組依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml濃度的華蟾素；聯合用藥組加入0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和華蟾素 10.00 μg/ml；對照組替代加入同劑量RPMI-1640培養液。分別培養24、48、72 h。四甲基偶氮唑藍比色法檢測各組對腦膠質瘤U251細胞增殖抑制的影響；并從中選出最優聯合濃度進行探討；RT-PCR和Western blotting方法檢測在不同干預條件下細胞中Paxillin、FAK、MMP-2基因和蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，華蟾素組、阿霉素組、華蟾素和阿霉素聯合組干預腦膠質瘤U251細胞后，其Paxillin、FAK、MMP-2在mRNA表達水平和蛋白表達水平均明顯下降，華蟾素和阿霉素聯合組下降更顯著，提示Paxillin表達的下降能引起FAK、MMP-2表達的相應下降，其機制可能是因為MMP-2是FAK信號的下游靶基因，FAK表達水平的高低會直接影響MMP-2的表達，但三者之間是通過何種信號通路傳遞？如何彼此相互作用、相互影響是我們需要繼續深入研究的方向。華蟾素和阿霉素聯合組可以顯著下調Paxillin基因的表達，進而相應引起FAK、MMP-2 mRNA和蛋白水平的降低，那么Paxillin表達水平的降低是否會引起腦膠質瘤U251細胞相應生物學行為發生改變呢？Boyden chamber小室體外侵襲實驗檢測華蟾素、阿霉素、華蟾素聯合阿霉素對腦膠質瘤U251細胞侵襲、遷移能力的變化，結果顯示：與對照組相比，華蟾素、阿霉素單藥組、聯合組均可以引起穿膜細胞數明顯減少，聯合組穿膜細胞數減少更顯著，Paxillin基因表達的下降可能引起腦膠質瘤U251細胞遷移能力的減弱，更進一步驗證華蟾素和阿霉素聯合具有可行性，兩者聯用通過抑制Paxillin基因的表達來阻止腫瘤細胞發生轉移增強抗腫瘤的作用。華蟾素不僅可以直接殺傷腫瘤細胞和減弱腫瘤侵襲力，還可聯合阿霉素產生協同效應，加強阿霉素對腫瘤細胞的敏感度，是較理想的化療藥物增效劑和保護劑。然而，為什么Paxillin基因表達的降低可以減弱腫瘤細胞的遷移能力，一方面這與FAK、MMP-2表達降低直接相關，還有無其它具體機制尚需進一步深入研究和探討。