沙丁胺醇治療重度哮喘急性發作療效及對患兒血清TOLL樣受體4、核轉錄因子κB通路的影響

馬立茵,李 靜

(1.錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121012；2.朝陽市第二醫院,遼寧 朝陽 122099)

支氣管哮喘(Bronchial asthma,BA)是由多種細胞(T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞)、細胞因子及各類活性炎癥介質協同作用導致的一類慢性炎癥性疾病，具有高應答性、慢性氣道炎癥及不可逆性損害等特點[1-2]。其主要臨床癥狀表現為反復發作性喘息、咳嗽，對患兒的生理、生長發育及心理健康均造成了嚴重的損害。當兒童哮喘急性發作，極易造成嚴重的低氧血癥和二氧化碳潴留，病情嚴重者甚至會發展為呼吸衰竭，對患兒的生命安全造成嚴重威脅。再加上兒童的中樞神經系統尚未發育成熟，因哮喘發作導致的缺氧、二氧化碳潴留還可能會影響患兒的智力和認知能力[3-4]。既往研究表明血清TOLL樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)的表達與氣道炎癥的發生發展過程存在密切的聯系，研究指出TLR4與氣道炎癥呈正相關，其水平高低可直接反映支氣管哮喘患者的炎癥嚴重程度[5-7]。核轉錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號通路主要與機體的自身免疫能力相關，可維持正常的機體生理功能，在調控細胞凋亡、細胞周期及分化等方面起著重要的作用。NF-κB信號通路的自身免疫在脊椎動物中主要表現為炎癥反應，長期的信號通路異常會對機體的性能產生不利的影響。因此基于以上兩類信號通路上對哮喘患者進行病情評估、療效監測具有現實意義。目前臨床上關于小兒支氣管哮喘的治療依舊以霧化吸入糖皮質激素、β2受體激動劑等藥物來控制炎癥、緩解哮喘癥狀為主[8]。硫酸鎂(MgSO4)是目前應用較廣的一類哮喘治療輔助藥物，在成人患者的應用治療中療效較好，可顯著改善哮喘加重導致的早期臨床癥狀，減少患者再入院概率[9]。沙丁胺醇是一類選擇性β2受體激動劑，具有較強的支氣管擴張作用，還可增強氣道黏液纖毛清除功能，抑制過敏介質釋放，有效緩解氣道痙攣癥狀。目前關于沙丁胺醇應用于兒童哮喘已有研究報道，但基于TLR4/NF-κB通路分析其療效價值仍無相關研究。因此，本文基于TLR4/NF-κB通路探討沙丁胺醇治療兒童重度哮喘急性發作的臨床療效，旨在為臨床治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2020年8月于我院治療72例重度哮喘急性發作兒童作為研究對象，按照隨機數字表法分為研究組和對照組，每組36例。另選取同期于我院行健康體檢的兒童36例作為正常組。其中，研究組年齡1～5歲，體重15～31 kg；對照組年齡1～5歲；體重15～30 kg；正常組年齡1～5歲，體重16～30 kg。三組患者的性別、年齡、體重、身高等一般資料比較差異無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。該研究通過我院倫理委員會的批準。病例納入標準：研究組和對照組入組患兒均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[10]中的相關診斷標準；存在哮喘癥狀急性發作、心率明顯增加、呼氣高峰流量(Peak expiratory flow，PEF)低于期望值的80%以及存在哮鳴音等任一臨床表征者；臨床資料完整，且依從性良好；不存在研究中所使用的藥物的相關過敏史；患兒及其法定代理人均充分知情同意，且自愿簽署知情同意書，愿意配合后續隨訪；病情為重度哮喘急性發作，無需急救措施。排除標準：存在心、肝及腎功能異常者；排除合并惡性腫瘤、嚴重器官功能衰竭者；排除存在心理障礙及精神障礙者；合并感冒、支氣管炎等其他原因引發咳嗽癥狀者；近3個月內存在糖皮質激素、抗體拮抗劑類藥物治療史者。

表1 三組患兒一般資料比較

1.2 干預方法 排除誘因、全身應用糖皮質激素、氧療及必要時采取機械通氣治療的基礎上，兩組患兒均采用面罩式一次性使用氧氣霧化吸入器(WK101-001 Ⅰ型，江蘇偉康潔婧醫療器械)治療,霧化液體積為3 ml，霧化治療時間為20 min。對照組患兒僅給予硫酸鎂注射液治療，將151 mg硫酸鎂注射液(國藥準字H12020994)溶于0.9%氯化鈉溶液中制備成濃度為33%的硫酸鎂霧化液，體積3 ml。研究組給予沙丁胺醇聯合硫酸鎂進行治療，將2.5 mg沙丁胺醇(國藥準字H31022999)與151 mg硫酸鎂充分溶于0.9%氯化鈉溶液液中制成3 ml霧化液，兩組均治療3個月。正常兒童不做任何藥物處理，僅在3個月治療期內完善治療前后的相關檢查。

1.3 觀察指標

1.3.1 臨床療效評價：參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中哮喘急性發作治療評價標準制定本研究療效評價標準。顯效，FEV1或PEF指標數值高于預期值的60%；有效，FEV1或PEF指標數值處于預期值40%～60%之間；無效，FEV1或PEF指標數值低于預期值的40%。記錄兩組患兒肺內哮鳴音、咳嗽、氣促等臨床癥狀體征消失時間及哮喘復發時間。

1.3.2 肺功能監測：應用哮喘電子檢測儀(NK360)分別檢測三組治療前后的肺功能相關指標，包括第1秒用力呼氣量(Forced expiratory volume in the first second，FEV1)、PEF、用力肺活量(Forced vital capacity，FVC)、用力呼出50%肺活量時的瞬間呼氣流量(Forced expiratory flow at 50% of FVC，FEF50%)，計算FEV1/FVC值。

1.3.3 血清炎癥因子檢測：三組均于治療前后在空腹狀態下采集肘靜脈血，經抗凝、離心處理后，保留血清并凍存于-80 ℃環境中，待統一檢測。應用酶聯免疫吸附法檢測血清中白細胞介素-4(Interleukin-6，IL-4)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)水平。試劑盒均由美國R&D公司生產，所有操作均嚴格按照說明書的標準執行，控制批內差異<10%，批間差異<15%。

1.3.4 TLR4、NF-κB mRNA檢測：應用Q-PCR法檢測外周血單核細胞TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達水平，結合文獻并參照美國Invitrogen 公司提供的mRNA序列，通過Primer 5軟件設計并分析引物,mRNA檢測步驟RT反應嚴格參照說明書執行操作。采用相對表達量分析法進行數據分析，指標為2-△△Ct。

1.3.5 不良反應：觀察治療期間兩組患兒不良反應發生情況。

2 結 果

2.1 兩組患兒臨床療效比較 研究組治療有效率為94.44%顯著高于對照組66.67%(χ2=8.867，P<0.05)。研究組氣促、咳嗽、肺內哮鳴音消失時間均明顯短于對照組，研究組哮喘復發時間明顯長于對照組(均P<0.05)。見表2、3。

表2 兩組患兒臨床療效比較[例(%)]

2.2 三組患兒肺功能比較 治療前，研究組和對照組患兒FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%肺功能指標水平均明顯低于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對照組患兒FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指標水平均顯著提升(均P<0.05)，其中研究組肺功能改善情況明顯優于對照組(均P<0.05)。見表4。

表3 兩組患兒癥狀體征消失時間和哮喘復發時間比較

表4 三組患兒肺功能指標比較

2.3 三組患兒血清炎癥因子水平比較 治療前，研究組和對照組患兒IL-1β、IL-4及TNF-α等炎癥因子水平均高于正常組，IFN-γ水平低于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對照組患兒IL-1β、IL-4及TNF-α表達水平均顯著下降，IFN-γ水平明顯提升(均P<0.05)，其中研究組IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明顯大于對照組，IFN-γ水平增幅大于對照組(均P<0.05)。見表5。

表5 三組患兒血清炎癥因子水平比較(ng/L)

2.4 三組患兒TLR4、NF-κB信號通路相關基因變化比較 治療前，研究組和對照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達水平均高于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達水平均顯著下降(均P<0.05)，其中研究組TLR4 mRNA水平高于對照組，NF-κB mRNA基因表達水平低于對照組(P<0.05)。見表6。

表6 三組患兒TLR4、NF-κB信號通路相關基因變化比較

2.5 兩組患兒不良反應發生情況比較 兩組患兒在治療期間均未出現嚴重的不良反應，停藥后均得到明顯緩解，研究組不良反應總發生率為19.44%高于對照組11.11%，但組間比較差異無統計學意義(χ2=0.966，P>0.05)，見表7。

表7 兩組患兒不良反應發生情況比較[例(%)]

3 討 論

隨著社會的迅猛發展，人們的生活水平和生活環境也發生了極大的變化，兒童哮喘的誘因也在不斷發生變化。我國哮喘流行病學調查顯示，我國城市兒童哮喘患病率在近20年間顯著增長，從1990年的0.11%～2.03%到2010年的0.42%～5.73%，發病率幾近翻番，分析數據不難發現，多數患兒及其家長對哮喘的危險因素認知不足，致使患兒用藥不規范、未進行系統化規范化的治療等現象較為普遍[11-12]。支氣管哮喘急性發作是兒科臨床的常見急癥，其中重度急性發作通常表現為心率顯著增加和三凹征、奇脈、滿肺哮鳴音，情節嚴重者甚至會出現低氧血癥及意識障礙，甚至可能危及生命。

硫酸鎂是一類臨床常用的解痙藥物，對平滑肌具有良好的擴張作用，且安全性較好，可用作哮喘治療的輔助藥物。相關報道顯示，硫酸鎂霧化治療應用于成人哮喘患者的療效顯著，可有效改善其因哮喘加重引發的早期臨床表現，減少其住院治療的幾率。針對吸入支氣管擴張劑沒有良好反應的急性重癥哮喘成人或兒童，采用硫酸鎂靜脈滴注治療有效且其安全性較高。但關于硫酸鎂霧化應用于哮喘患者治療的研究結論尚未完全統一說法[13]。短效β受體激動劑(Short acting beta agonists，SABA)是用于緩解哮喘急性發作的常用藥，其臨床療效確切且應用較廣，但對于中-重度哮喘急性發作的患兒的癥狀控制效果并不理想。沙丁胺醇是一種選擇性的β2受體激動劑，對支氣管有著較強的擴張作用，可興奮氣道平滑肌和肥大細胞膜表面的β受體，舒張氣道平滑肌，抑制肥大細胞和嗜堿細胞脫粒顆粒和過敏介質的釋放、降低微血管通透性、增強氣道上皮纖毛擺動等來有效緩解氣道高反應[14]。

目前臨床有大量研究證實硫酸鎂與沙丁胺醇聯用對兒童支氣管哮喘急性發作的治療效果十分顯著。本研究結果顯示，在治療前，硫酸鎂聯合沙丁胺醇吸入治療的研究組患兒和單純硫酸鎂治療的對照組患兒的肺功能指標、炎癥因子水平、TLR4 mRNA及NF-κB mRA基因表達情況均與正常組有統計學差異，表明以上指標的選擇均具有較好的臨床意義。其中研究組治療有效率為94.44%顯著高于對照組66.67%；研究組氣促、咳嗽、肺內哮鳴音消失時間均明顯短于對照組，研究組哮喘復發時間明顯長于對照組。兩組患兒肺功能均得到明顯改善，但聯合治療的臨床獲益更佳，研究組FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指標水平均明顯高于對照組。進一步比較兩組炎癥因子水平發現研究組患兒的IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明顯大于對照組，IFN-γ水平增幅大于對照組。提示硫酸鎂聯合沙丁胺醇霧化吸入治療可有效抑制哮喘兒童急性發作期炎癥因子的釋放，有效抑制氣道的過敏反應，進而改善其臨床癥狀和呼吸功能，有效降低其復發率。分析認為長期反復應用β2受體激動劑進行治療會導致支氣管細胞膜上β受體對激動的敏感性降低，再加上急性重度發作哮喘兒童自身β2受體功能較差，對腺苷酸環化酶的激活不足，進而導致細胞cMAP濃度偏低。而硫酸鎂中的鎂離子可激活腎上腺能β受體功能，增強β受體與激動劑之間的親和力，且可對β2受體起到一定的調節作用，從而增強β受體激動劑的支氣管擴張效果。硫酸鎂對腺苷酸環化酶有著激活作用，使得三磷酸腺苷生成環磷酸腺苷，進而提高cAMP/cGMP的比值，抑制肥大細胞介質的釋放，同時可活化蛋白酶系統、降低細胞內鈣離子水平，促使氣管內平滑肌松弛，降低氣道阻力，有效解除氣管痙攣，改善肺循環功能，消除支氣管黏膜水腫，保障氣道通暢，發揮擴張支氣管的作用[15-16]。兩者作用機制不同，聯用能夠產生協同作用提高療效。此外，兩組患兒在治療期間均未出現嚴重的不良反應，停藥后均得到明顯緩解，研究組不良反應總發生率為19.44%高于對照組11.11%，但組間比較差異無統計學意義，表明沙丁胺醇不會增加不良反應，安全性較高。翁蔚琪等[17]研究證明，硫酸鎂聯合硫酸沙丁胺醇霧化吸入治療小兒中-重度支氣管哮喘發作的療效較好，可顯著改善患兒肺功能，縮短住院時間，降低ICU留治率，與本研究結論基本一致。

NF-κB信號通路與機體的自身免疫相關，此通路可維持正常的機體功能。TLR4細胞內的TOLL/IL-1受體結構域可與MyD88的羧基端相互結合，結合體與IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor associatedkinase，IRAK)的氨基端再度結合，激活IRAK。被激活后的IRAK再激活腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF Receptor-associated factors 6，TRAF-6)，活化后的TRAF-6進而激活NF-κB抑制物的激酶(Inhibitor of NF-κB kinases，IKKs)復合物。金平飛等[18]研究指出，IKKs復合物可促進NF-κB抑制物磷酸化和降解，進而促進NF-κB的有效激活，繼而誘導特定基因轉入細胞核內并表達，誘導炎性細胞因子的表達。研究顯示，TLR/NF-κB信號通路若長期處于活化的狀態下，則會持續引發嚴重反應，最終導致肺部功能出現病理性改變[19-20]。姚雪紅[21]以60例住院患兒為研究對象，隨機分為治療組和對照組各30例,另設30例健康兒童作為正常組。治療組采用咳喘平顆粒治療,對照組采用孟魯司特鈉顆粒治療,結果顯示，相關治療藥物可通過抑制IRAK磷酸化,來對TLR4/NF-κB信號通路進行調控，使其處于活化狀態,改善氣道炎性反應,從而改善喘息性支氣管炎(寒性哮喘)患兒的臨床癥狀。本研究中顯示，治療后，研究組和對照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達水平均顯著下降，且研究組NF-κB mRNA顯著低于對照組。提示沙丁胺醇可顯著降低IL-1受體相關激酶的水平，TLR4可結合的受體濃度降低，對IRAK的激活能力降低，進而使得患兒血清內的TRAF-6因子水平降低，使得后續一系列鏈化反應無法繼續發生，進而顯著下調NF-κB mRNA、TLR4 mRNA表達水平。這與本研究組患兒的IL-1β、IL-4及TNF-α水平顯著低于對照組結論相互照應。

綜上所述，沙丁胺醇霧化吸入治療可有效改善重度哮喘急性發作兒童的臨床癥狀，延長其哮喘復發時間，顯著改善患兒的肺功能，降低血清炎性因子表達水平，減輕炎癥損傷，降低TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達水平，且安全性較好。本研究為單中心、小樣本研究，所得結論存在一定的局限性，有待擴大化的多中心試驗證實。