扶正合劑質量標準提高研究

盧向紅 賀敏才 汪 霞

湖南省婁底市食品藥品檢驗檢測所,湖南 婁底 417000

扶正合劑是由湘潭建春醫院制劑室生產的中藥制劑，其處方組成為黃芪、雞血藤、補骨脂和女貞子。具有益氣養陰的功效，臨床主要用于惡性腫瘤及其放療、化療后氣陰兩虛所致面色不華、神疲乏力、口干咽燥的輔助治療[1]。該藥處方中黃芪為君藥，現代藥理實驗[2]表明黃芪中黃芪甲苷具有增強機體免疫力、提高機體抗病毒能力、抗應激功效、作為促生長劑及改善心肺功能等作用。補骨脂為臣藥，現代藥理研究[3]表明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗真菌等作用，《中國藥典2020年版》以補骨脂素和異補骨脂素，作為藥材和飲片質量控制的指標性成分[4]。扶正合劑現行的質量標準為《湖南省醫療機構制劑規范2016年版》，標準中僅有性狀鑒別、薄層色譜鑒別、相對密度、pH值及制劑通則項下的檢查項目，缺少有效成分含量測定的項目，制劑質量難以得到有效地控制。本文采用高效液相色譜法[5]測定扶正合劑中黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，制定了與臨床療效相關的成分含量控制方法，對增強藥品質量可控性，保證臨床用藥安全有效，具有十分重要的意義，為進一步提高和完善藥品質量標準提供科學依據。

1 儀器與試藥

Waters HPLC色譜儀(e2695-W2424)，Empower 色譜工作站。Thermo Fisher HPLC色譜儀(U3000)， Chromeleon色譜工作站。梅特勒托利多 XSE205DU電子天平(十萬分之一)。水為I級純化水，乙腈(HoneyWell，批號：T8FA1H)為色譜純，磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190301)為優級純，正丁醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20200703)，氨水(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20191105)，甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180518)均為分析純。

黃芪甲苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110781-201717，含量96.9%)；補骨脂素購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110739-201617，含量99.7%)；異補骨脂素購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110738-201715，含量99.5%)；扶正合劑：湘潭建春醫院制劑室，批號201125、200710、201110。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 黃芪甲苷色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，流動相：乙腈-水(34∶66)，流速：1.0 mL·min-1，蒸發光散射檢測器(漂移管溫度：80.0 ℃，氣體壓力為30 psi，增益值為150，噴霧器溫度：42.0 ℃)。

2.1.2 補骨脂素和異補骨脂素色譜條件 色譜柱：Shim-Pack VP-ODS 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，乙腈-0.1%磷酸溶液(30∶70)，流速∶1.0 mL·min-1，二極管陣列檢測器，檢測波長：245 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 對照品溶液1：精密稱取黃芪甲苷對照品17.68 mg，加甲醇制成每 1 mL 含黃芪甲苷0.3426 mg·mL-1的溶液，備用。

對照品溶液2：精密稱取補骨脂素對照品10.95 mg，加甲醇制成每1 mL含補骨脂素 0.4367 mg·mL-1的溶液，精密稱取異補骨脂素對照品10.60 mg，加甲醇制成每1 mL含異補骨脂素0.5274 mg·mL-1的溶液，各精密取1.00 mL，加甲醇配成含補骨脂素8.734 μg·mL-1和異補骨脂素10.547 μg·mL-1混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 供試品溶液1：取本品10支內容物混勻，精密量取20 mL，用水飽和正丁醇液提取3次(50 mL，30 mL，30 mL)，合并正丁醇液，加氨試液30 mL，搖勻，放置16 h，棄去水層，再用正丁醇飽和的水100 mL洗滌，取正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，搖勻。

供試品溶液2：取本品10支內容物混勻，精密量取10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超聲提取30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取分別缺黃芪、補骨脂的處方制成陰性樣品，再分別按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液1和陰性對照溶液2。

2.3 系統適用性試驗

2.3.1 黃芪甲苷 分別取對照品溶液1、供試品溶液1、陰性對照溶液1進樣20 μL，色譜圖見圖1。黃芪甲苷峰保留時間約為15 min，陰性對照色譜圖在黃芪甲苷峰位置無干擾峰。

2.3.2 補骨脂素與異補骨脂素 分別取對照品溶液2、供試品溶液2、陰性對照溶液2進樣10 μL，色譜圖如圖2，陰性對照色譜圖在補骨脂素與異補骨脂素峰位置無干擾峰。

2.4 線性關系考察

2.4.1 黃芪甲苷 精密吸取對照品溶液10、15、20、25、30 μL按上述色譜條件測定，以峰面積對數為縱坐標，以進樣量對數為橫坐標，進行線性回歸，得方程見表1。

2.4.2 補骨脂素與異補骨脂素 精密吸取對照品溶液5、10、15、20、25 μL按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，以進樣量為橫坐標，進行線性回歸，得方程見表1。

1.黃芪甲苷圖1 對照品(A)、扶正合劑樣品(B)、缺黃芪陰性樣品(C)的HPLC色譜圖

1.補骨脂素;2.異補骨脂素圖2 對照品(A)、扶正合劑樣品(B)、缺補骨脂陰性樣品(C)的HPLC色譜圖

表1 扶正合劑中黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素的線性關系考察結果

2.5 精密度試驗 取對照品溶液連續進樣6次，記錄峰面積，結果黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素峰面積的RSD分別為2.67%、0.12%和0.11%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號(201125)樣品6份，按2.2.2項下供試品液制備方法，分別制備成供試品溶液，依法測定，結果黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素含量RSD分別為0.96%、1.55%和1.54%，表明本法重復性好。

2.7 穩定性試驗 取同一樣品溶液(批號：201125)在0、2、5、10、15、24 h分別進相同體積，依法測定，黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素峰面積RSD分別為2.59%、0.13%和0.11%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 精密取已知含量(黃芪甲苷0.09989 mg·mL-1)的同一樣品(批號：201125)10 mL，精密加入黃芪甲苷對照品溶液(0.4364 mg·mL-1)1 mL、2 mL、3 mL各3份。精密取已知含量(補骨脂素32.194 μg·mL-1，異補骨脂素 41.778 μg·mL-1)的同一樣品(批號：201125)5 mL，精密加入含補骨脂素(0.3220 mg·mL-1)和異補骨脂素(0.4219 mg·mL-1)混合對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL各3份，按2.2.2項下供試品液制備方法分別制備，按樣品測定方法測定含量，計算回收率，結果見表2，表明該方法準確度良好。

表2 扶正合劑中黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素加樣回收試驗結果 (n=9)

2.9 樣品測定 取三批樣品，按2.2.2項下方法分別制備供試品溶液，依法測定黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，結果見表3。

表3 扶正合劑中黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素含量測定結果

3 討論

3.1 提取方法的選擇

3.1.1 黃芪甲苷提取 通過查找文獻[5],黃芪中黃芪甲苷由兩部分組成，一部分是游離的黃芪甲苷，一部分是來自于黃芪甲苷衍生物的轉化，這兩部分黃芪甲苷的總和才是黃芪飲片中黃芪甲苷的總含量。黃芪甲苷衍生物轉化成游離的黃芪甲苷一般采用堿化的方法，其原理是黃芪甲苷衍生物在堿的作用下發生水解，轉變成游離的黃芪甲苷就可以被檢測到。影響黃芪甲苷衍生物的轉化的關鍵因素是氨試液的堿化時間，本實驗考察了加入氨試液振搖以后放置不同時間對黃芪甲苷含量的影響，放置20 min、1 h、16 h黃芪甲苷含量明顯逐漸升高，放置24 h與16 h的黃芪甲苷的含量變化不大，因此本實驗采用放置16 h。

提取溶劑的堿性加大到一定程度后，可能會造成黃芪甲苷的結構破壞使其含量降低，因此本實驗考察了加入不同體積氨試液對黃芪甲苷含量的影響，分別加入氨試液15 mL、30 mL、50 mL以及100 mL，結果加入15 mL和100 mL氨試液測得的黃芪甲苷含量比加入30 mL、50 mL氨試液測得的量低，從降低檢驗成本及環保角度考慮，本實驗采用加入30 mL氨試液的方法。

本實驗考察了水飽和正丁醇提取次數對含量測定結果的影響，分別用水飽和正丁醇提取5次(30 mL、20 mL、20 mL、20 mL、20 mL)，提取3次(50 mL、30 mL、30 mL)，結果黃芪甲苷含量變化不大，從提高檢驗效率考慮，本實驗采用提取3次的方法簡化實驗步驟。

3.1.2 補骨脂素和異補骨脂素提取 本實驗對補骨脂素和異補骨脂素的提取方法進行了探索，補骨脂素和異補骨脂素屬于呋喃香豆素類[6]，本實驗曾用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干再用甲醇溶解稀釋；用甲醇超聲提取等前處理方法，結果用乙酸乙酯萃取后，保留時間5 min之前的雜質峰有所減少，但是操作復雜，用甲醇超聲提取，測出樣品含量比較高，樣品中其他成分峰對主峰無干擾，結果準確，重復性好，因此本實驗采用甲醇超聲提取的方法。考察了提取15 min、30 min和45 min 3個時間，結果提取15 min含量偏低，30 min和45 min含量沒有顯著差異，因此本實驗采用30 min超聲提取。

3.2 檢測方法選擇 黃芪甲苷的紫外吸收為末端吸收，在紫外檢測器下的響應值低，因此本實驗采用通用型的蒸發光散射檢測器，儀器靈敏度高，信號穩定。采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果補骨脂素和異補骨脂素在245 nm波長處有最大吸收，為提高檢測靈敏度，因此選擇245 nm作為補骨脂素和異補骨脂素的檢測波長。

3.3 流動相選擇 蒸發光散射檢測器的流動相不能使用非揮發性的試劑[7]，通過查閱文獻[8-10],黃芪甲苷的測定大部分采用乙腈-水流動相系統，經過反復比較不同比例，采用乙腈-水(34∶66)等度洗脫，樣品中黃芪甲苷與相鄰峰達到基線分離，峰形對稱性好。通過查閱文獻[11-12],在實驗過程中分別考察了甲醇-水，乙腈-水，0.1%磷酸溶液-乙腈，0.4%磷酸溶液-乙腈等流動相系統及多個比例，經過反復比較，采用0.1%磷酸溶液-乙腈(70∶30)等度洗脫，補骨脂素、異補骨脂素與相鄰峰達到基線分離，峰形對稱性好，出峰時間合適。

4 結論

黃芪和補骨脂分別為扶正合劑中的君藥與臣藥，黃芪甲苷為黃芪的功效性成分，補骨脂素和異補骨脂素為補骨脂的指標性成分，本實驗采用高效液相色譜法測定扶正合劑中黃芪甲苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量，結果準確，重復性好，專屬性強，且樣品前處理方法簡便，提取效率高，為更好地控制扶正合劑的質量提供了依據。