濕熱處理輔助酶法制備大米多孔淀粉及其性質研究

張倩倩， 徐 超， 曹俊英， 章 中

(寧夏大學食品與葡萄酒學院1，銀川 750021) (寧夏昊王米業集團有限公司2，銀川 751400)

淀粉被認為是自然界中僅次于纖維素的第二大類可再生碳水化合物。作為一種天然有機資源，淀粉已經成為我國重要的食品及化工原料。為了更好地滿足市場需求，常常對淀粉進行改性處理，目前常用的改性方法有化學改性、物理改性、生物改性和復合改性[1]；濕熱處理作為一種物理改性的方法因其僅涉及水和熱，不涉及化學試劑安全無害逐漸受到關注[2]。謝瑩[3]將小麥淀粉經過濕熱處理后，發現淀粉對酶的敏感性會增強，有利于被酶解生成多孔淀粉。目前有關大米淀粉濕熱處理后，用復合酶法水解制備多孔淀粉的研究還鮮有報道。

本研究以寧夏大米為原料，通過濕熱處理對淀粉進行改性，測定了淀粉的比容積、溶解率、膨脹率、吸油率和亞甲基藍吸附量等理化指標，借助X-晶體射線衍射、傅里葉紅外光譜、電子掃描顯微鏡和粒度分析儀表征淀粉的結構，為大米多孔淀粉的制備提供了新方法，為寧夏大米的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米原料(寧粳50)；大米純淀粉，實驗室自制[4]；α淀粉酶(活性≥10 U/mg)、糖化酶(活性≥10萬U/g)；DNS顯色劑(3,5-二硝基水楊酸)、亞甲基藍；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸，均為分析純；植物油。

1.2 儀器與設備

JDG-0.2真空凍干實驗機，DF-II數顯集熱式磁力攪拌器，772可見分光光度計，Spectrum Two 傅里葉紅變換紅外光譜儀，Smart Lab X射線衍射儀，ZEISS EVO18掃描電鏡，Mastersizer3000全自動激光粒度分析儀。

1.3 方法

1.3.1 濕熱處理淀粉的制備

準確稱取一定質量的大米淀粉于燒杯中，加蒸餾水調節含水量，充分攪拌后立即置于不銹鋼容器中密封，置于25 ℃水浴鍋中平衡20 h后，在恒溫干燥箱中以一定溫度處理一段時間，冷凍干燥后碾磨過100目篩得經濕熱處理的淀粉，根據預實驗結果，確定濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉的濕熱處理條件為：含水量15%、20%、25%、30%、35%，處理溫度100 ℃，處理時間5 h；處理溫度95、100、105、110、115 ℃，含水量30%，處理時間5 h；處理時間3、4、5、6、7 h，含水量30%，處理溫度100 ℃。

1.3.2 濕熱處理淀粉對酶敏感性的測定

稱取0.4 g濕熱處理大米淀粉，加入20 mL蒸餾水，于燒杯中混合均勻，再加pH4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液5 mL，50 ℃水浴平衡10 min，加入1 mL酶液(α淀粉酶1 mg,糖化酶5 mg，溶于1 mL蒸餾水中)搖勻，50 ℃恒溫振蕩反應1 h后，立即加入質量分數為4%NaOH溶液2.5 mL終止反應，以4 000 r/min離心10 min，用3,5-二硝基水楊酸(DNS)方法測量釋放的葡萄糖的量。根據公式計算淀粉對酶的敏感性。

式中：c為DNS比色法測得的葡萄糖質量濃度/mg/mL;V為反應體系中液相體積/mL；0.9為從葡萄糖到淀粉的轉化系數；m為反應前淀粉質量/mg。

1.3.3 多孔淀粉的制備

復合酶法制備多孔淀粉采用包軍鵬等[5]的方法，濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉是在經過濕熱處理后再進行酶解，酶解時間為復合酶法制備多孔淀粉的一半，其余工藝條件不變。

1.3.4 吸油率測定

稱取0.5 g多孔淀粉置于小燒杯中，與5 mL的植物油混合攪拌30 min，倒入已知質量的離心管中，以4 000 r/min離心10min，倒出離心后的上層液，倒置至油不再滲出，根據公式計算吸油率。

式中：W0為離心管的質量/g;W1為多孔淀粉干質量/g;W2為離心后離心管和吸(油)后的淀粉質量/g。

1.3.5 亞甲基藍吸附測定

稱取50 mg淀粉加入到50 mL 亞甲基藍(MB)溶液(30 mg/L)中。將其在 25 ℃的恒溫振蕩器(170 r/min)中吸附2 h 后，以3 000 r/min 離心 15 min。使用紫外分光光計在 665 nm 處測量吸光度。根據公式計算平衡吸附容量Qe。

式中：Co和Ce分別是初始濃度和平衡濃度/mg/L；V為反應溶液體積/mL；m為淀粉樣品質量/mg。

1.3.6 溶解率和膨脹率測定

稱取0.4 g淀粉，加入20 mL蒸餾水于燒杯中混合均勻，在60 ℃下攪拌30 min，以3 000 r/min離心20 min，將上清液置于蒸發皿中沸水浴蒸干，于 105 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重。根據公式計算溶解率(S)和膨脹率(B)：

式中：A為上清液烘干后質量/g；W為淀粉樣品干質量/g；p為離心后沉淀質量/g。

1.3.7 比容積測定

稱取2 g淀粉，于 10 mL 量筒中，使淀粉自由落下，晃動量筒保持淀粉面水平，讀數，計算每克淀粉所占的體積，即為淀粉的比容積。

1.3.8 傅里葉紅外光譜測定(FTIR)

將待測干燥淀粉在1∶200 比例下與溴化鉀充分的混合、研磨，壓片成型，在4 000～400 cm-1波數范圍 ，分辨率為1 cm-1條件下檢測。

1.3.9 X-晶體射線衍射測定

將待測干燥淀粉在Cu Kα(λ=0.1540 6 nm),功率為 1 600 W(40 kV×40 mA),掃描范圍為 5°～40°(2θ)，掃描速度5(°)/min,步長 0.02°的條件下檢測。

1.3.10 表面結構分析

用電子掃描顯微鏡(SEM)和全自動激光粒度分析儀對淀粉顆粒進行表面結構掃描和粒度分析。

1.3.11 數據處理與統計分析

本研究均進行3次重復實驗，采用SPSS 24.0軟件統計分析實驗數據,采用Origin pro 9.1軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 濕熱淀粉制備的實驗結果

如圖1所示，含水量對淀粉酶敏感性的影響最大，隨著含水量的增加，淀粉對酶的敏感性也隨之增加，且含水量為15%～30%時對酶敏感性表現差異顯著，當含水量為30%時，淀粉對酶敏感性是原淀粉的3.48倍，當含水量達到30%后，濕熱處理淀粉對酶敏感性的變化不大。隨著含水量增大，淀粉顆粒體積膨大，會增加支鏈淀粉附近的α-1,6糖苷鍵發生斷裂的可能性，淀粉的結構會發生重排，淀粉的無定形區對酶的可及性會增加[6]，因此，淀粉對酶的敏感性會增強，當含水量繼續增加時，會導致糊化過度，反而降低了淀粉對酶的敏感性。

圖1 不同影響因素對酶敏感性的影響

當溫度從95 ℃上升到110 ℃時，淀粉對酶的敏感性增大，且差異顯著，當溫度繼續增大時，淀粉對酶的敏感度反而降低，這是因為在一定溫度范圍內熱和水的交互作用，使支鏈淀粉降解，雙螺旋結構減少，有利于淀粉酶作用[7]，當溫度超過110 ℃時，糊化程度過高，鏈與鏈之間會發生交互作用，產生更為緊密的雙螺旋結構，不利于淀粉無定形區對酶的可及性。

在3～6 h內，隨著處理時間延長，濕熱處理淀粉對酶敏感性增大，當時間繼續增大，酶敏感性反而降低，差異不顯著。當處理時間超過6 h后，淀粉無定形區的直鏈淀粉向雙螺旋結構、結晶區的雙螺旋結構的轉變增大[8]，會阻礙淀粉酶的作用，使淀粉對酶的敏感性降低。

2.2 淀粉吸附性能比較

由表1可得，復合酶制備多孔淀粉的吸油率較原淀粉增長了78.64%，亞甲基藍吸附量較原淀粉增長了20.00%，在含水量為30%，處理溫度為110 ℃，處理時間為6 h的條件下，制得的多孔淀粉吸油率與亞甲基藍吸附量最大，吸油率較原淀粉增長86.01%，亞甲基藍吸附量較原淀粉增加了62.22%，這是因為對多孔淀粉來說，由于其結構更為疏松，且表面有更多孔洞，這些孔洞產生的吸引力更為集中有助于吸附作用[9]，所以其吸附能力遠遠大于原淀粉，經過適宜濕熱條件處理后，淀粉對酶敏感性也會增加，而且含有較多破損顆粒，再進行酶解其吸附效果優于復合酶法制備多孔淀粉。含水量30%，處理溫度110 ℃，處理時間6 h為制備多孔淀粉的濕熱處理工藝的最佳條件，故實驗選用該條件進行濕熱處理。

表1 不同淀粉吸附性分析

2.3 淀粉理化性質比較

由表2可知，原淀粉與濕熱淀粉的比容積、溶解率、膨脹率和吸油率略有增加，經過酶解后，濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉的比容積較原淀粉增加，這是因為淀粉形成了中空結構，當淀粉的質量相同時，多孔淀粉的體積會更大，所以比容積也會增高。濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉的溶解率與膨脹率較原淀粉增加，酶水解后，非結晶區的直鏈淀粉會浸出，所以淀粉的溶解率會增加[10]。淀粉酶解成孔后，會降低淀粉的結構強度，水分子更容易進入淀粉內部，導致淀粉的膨脹率增加。

表2 不同淀粉性質分析

2.4 淀粉晶體結構觀察

如圖2所示，原淀粉、濕熱淀粉、復合酶法制備多孔淀粉、濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉在15°、23°、17°、18°處顯示出4個主峰，表明結晶型是A型，濕熱處理并沒有改變淀粉的結晶構型[11]，但是其衍射峰的強度降低，這與王宏偉等[12]報道的結果一致。原淀粉的結晶度為36.65%，濕熱處理淀粉結晶度略低于原淀粉；濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉結晶度略高于原淀粉。這是因為濕熱處理使淀粉發生部分糊化或者雙螺旋結構被破壞，導致淀粉的結晶度降低[13]，多孔淀粉的結晶度有所增大是因為濕熱處理增加了酶對淀粉無定形區域的可及性，無定形淀粉比結晶淀粉更容易被酶解[14]。

圖2 不同淀粉的X-晶體射線衍射圖

2.5淀粉紅外結構表征

如圖3所示，經過濕熱處理跟酶解后的淀粉特征吸收峰沒有明顯變化，說明淀粉的基本化學結構沒有被改變。1 047 cm-1和1 022 cm-1附近的紅外吸收與淀粉的結晶區和無定形區的結構特征有關[15]，淀粉1 047 cm-1和1 022 cm-1兩處的比值與淀粉的結晶度成正相關，原淀粉、濕熱淀粉以及濕熱處理輔助酶法制備多孔淀粉的1 047/1 022 cm-1值分別為1.15、1.09、1.21，這與X-晶體衍射的結果一致。

圖3 不同淀粉的紅外光譜圖

2.6 淀粉表面形態觀察

如圖4所示，原淀粉表面光滑，棱角顯著，經濕熱處理后，淀粉顆粒表面出現凹坑，顆粒破損程度較大，部分顆粒發生明顯的粘連現象[16]，為酶解反應中的淀粉酶增加了更多的吸附位點，增加了酶敏感性；經過濕熱預處理后，再經α淀粉酶和糖化酶酶解后得到多孔淀粉，發現淀粉表面形成大小相對均一的孔洞，由表面向中心內部貫穿，棱角不再突出，與單獨復合酶法制備的多孔淀粉相比孔洞更深，數量更多。因為部分淀粉為抗性淀粉，所以不是所有淀粉都可以生成多孔淀粉。

圖4 不同淀粉的掃描電鏡圖

2.7 淀粉粒度分布分析

D3,2表示表面積加權平均粒徑，對樣品中小顆粒的存在敏感；D4,3表示體積加權平均粒徑，對樣品中大顆粒的存在敏感；D50表示粒徑的體積分布下累計值，即樣品中小于該值的顆粒體積占了樣品總體積的50%[17]。比表面積表示單位質量物料所具有的總面積，比表面積越大，吸附能力越強。

由表3可以看出，經過濕熱處理后淀粉的D3,2、D4,3、D50均上升，這是因為淀粉經過濕熱處理會發生粘連現象，而且淀粉在熱和水的作用下顆粒膨脹[18]，所以淀粉的粒徑會增大，再經過酶解后，淀粉顆粒分散開來，說明淀粉的粘連現象經過酶解后顯著改善，與電鏡結果一致。多孔淀粉的中位徑達到5.55 μm，粒徑均明顯下降，說明淀粉被水解成小顆粒，且形成孔洞[19]，形成比表面積較大的多孔淀粉有利于增加吸附能力。

表3 不同淀粉粒度分布

2.8 淀粉吸附等溫線分析

使用Langmuir和 Freundlich等溫線模型擬合2種多孔淀粉吸附不同初始濃度的亞甲基藍溶液平衡數據，其表達式分別為：

式中：Ce為吸附平衡時溶液中亞甲基藍的質量濃度/mg/L;Qe為多孔淀粉對亞甲基藍的平衡吸附量/mg/g；Qm為多孔淀粉對亞甲基藍的最大吸附量/mg/g；b與KF分別表示Langmuir模型和Freundlich模型特征參數；n為Freundlich模型相關因數。

表4 吸附等溫線擬合參數

3 結論

一定程度的濕熱預處理有助于酶法制備多孔淀粉。大米淀粉濕熱預處理的最佳工藝條件為：含水量30%、處理時間6 h、處理溫度110 ℃。在此反應條件制備的多孔淀粉的比容積、溶解度、膨脹度、吸油率較原淀粉都大幅增加，XRD結果表明，原淀粉、濕熱淀粉、多孔淀粉的結晶型是A型，濕熱處理并沒有改變淀粉的結晶構型；FTIR圖譜表明原淀粉、濕熱淀粉、多孔淀粉的特征吸收峰沒有明顯變化，說明淀粉的化學結構沒有被改變；SEM和粒度分析表明，濕熱處理后淀粉表面出現凹坑，酶解后形成相對均勻的孔洞。證明濕熱處理可有效增加淀粉對酶的敏感性，減少酶解反應時間，制備吸附性良好的多孔淀粉。