一例雞金黃色葡萄球菌感染的分離與藥敏試驗

岑明珠，張輝華

（佛山科學技術學院，廣東 佛山 528200）

葡萄球菌在自然界中分布廣泛，在健康禽類的皮膚、眼瞼、黏膜、胃腸道都有葡萄球菌的存在，同時也存在于禽類養殖場、孵化場、飼料加工廠等。葡萄球菌多數為非致病菌，少數致病性葡萄球菌可以穿過皮膚或黏膜引起發病。葡萄球菌是一種共生細菌，具有致病性，是非常廣泛的化膿性細菌之一，葡萄球菌有可能引起75%～85%的化膿性疾病，會引起禽類的組織器官受感染以及化膿，嚴重時可引起膿毒敗血癥。另外，在養殖生產中由于抗生素的頻繁使用，金黃色葡萄球菌的耐藥感染一直備受關注[1]，大量抗生素應用于集約化養殖場，導致耐藥菌株逐漸出現，耐藥譜不斷擴大，有效的敏感藥物日漸減少，使得該病一旦發病難以控制，給養殖業帶來一定損失，因此選擇合適敏感的藥物顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病死雞只來源于福建省地區養殖場的病雞，病料具體背景信息如表1所示。

表1 病料的背景信息

1.2 試驗試劑

LB瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）、LB肉湯（廣東環凱微生物科技有限公司）、MH瓊脂（廣東環凱微生物科技有限公司）；藥敏試紙（廣州市迪景微生物有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

50 × TAE緩沖液制備：稱取Tris 121 g、Na2EDTA·2H2O（372 g/mol）9.3 g、冰醋酸28.55 mL、NaOH 1.55 g，加入蒸餾水定容至500 mL，常溫保存備用。

1×TAE緩沖液制備：10 mL50×TAE緩沖液，加去離子水至500 mL。

1%瓊脂糖凝膠制備：稱取1 g瓊脂糖，加入含有100 mL 1 × TAE緩沖液，于微波爐中加熱融化至液體澄清透亮并冷卻至40～ 60 ℃后加入5 μL核酸染料，混勻后倒入放有凝膠板的凝膠盤中（膠板厚度約5 mm，根據樣品數量選擇對應梳子），膠冷卻凝固后拔出梳子，將電泳凝膠水平放入電泳槽中，加入1×TAE緩沖液淹沒凝膠液面。

1.3 主要儀器

高速離心機（美國Thermo公司）、PCR儀（美國Thermo公司）、生物安全柜（美國Thermo公司）、恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、凝膠成像系統（北京榮陽經典科技有限公司）、高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）、凝膠電泳裝置（北京榮陽經典科技有限公司）。

1.4 金黃色葡萄球菌的分離純化

1.4.1 病料的采集

先將病死雞剖解，觀察以及記錄病變部位和情況，用一次性無菌接種環采集雞的關節、骨髓、肝臟等部位。

1.4.2 細菌的分離

將采集到的關節滲出液、骨髓、肝臟等用LB普通瓊脂培養基進行三分區劃板，然后放置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。

1.4.3 細菌的增殖及收獲

細菌放置在37 ℃恒溫培養箱培養12 h后，每種細菌挑平板上的單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細菌形態，將分離菌進行單菌落劃線，用普通LB肉湯放置在37 ℃恒溫培養箱中存放，培養12 h純化后進行鑒定。最后培養過的分離菌暫時存放在-4 ℃冰箱中。

1.4.4 染色鏡檢

將疑似的菌株進行染色鏡檢：取潔凈的載玻片于火焰上反復拖拉幾次，用移液槍取10 μL蒸餾水，用接種環挑取菌落邊緣少許細菌，與玻板上的蒸餾水混勻涂抹開，懸于火焰上方，火焰固定；滴加結晶紫染色液計時1 min后水洗；滴加碘液計時1 min后水洗；滴加脫色酒精，計時約30 s后水洗；滴加沙黃復染液，復染1 min后水洗晾干，轉到光學顯微鏡下，選擇合適放大倍數觀察細菌的形態。

1.5 細菌的PCR鑒定

1.5.1 引物的設計與合成

上游引物27F序列：AGTTTGATCMTGGCTCAG，下游引物1492R序列：GGTTACCTTGTTACGACTT，引物由廣州擎科生物科技有限公司合成。

1.5.2 細菌的DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書對細菌基因組進行抽提，將抽提所得產物收集于2 mL離心管中，短期存于4 ℃，長期存于-20 ℃備用。

按照擎科生物科技有限公司的試劑盒說明書進行，在生物安全柜中配置25 μL的PCR體系，具體包括：上游引物PF（10P）1 μL，下游引物PR（10P）1 μL，模板gDNA 1 μL，蒸餾水H2O 22 μL。將混勻的上述液體放入PCR儀中進行PCR擴增，該體系的反應如下：98 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃復性15 s，72 ℃延伸15 s。以上進行35個循環，然后72 ℃后延伸5 min。

1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠點樣：取20 μL PCR擴增產物加入各加樣孔中，并加入對應的陰性對照與陽性對照，同時設定標準分子量Maker做分子質量大小對照。

結果觀察和判斷：電泳結束后，關閉電源，把凝膠從電泳液中取出來，放入凝膠成像系統中，UV紫外燈下觀察核酸條帶并讀取結果。

1.5.4 藥敏試驗

參照常規K -B藥敏試紙擴散法對分離的菌株進行藥敏試驗，對照菌株為金黃色葡萄球菌26003。取金黃色葡萄球菌新鮮培養肉湯，調整菌液濃度為1.0 × 106cfu/mL，蘸取菌液在MH平板上均勻涂抹，每次涂抹將平板旋轉60°，最后沿平板周邊繞轉2圈，保證涂抹均勻；待平板水分被完全吸收后，夾取一張藥敏試紙，放于平板表面，輕輕按壓使其貼平，重復2個平行，置于37 ℃培養18～24 h，觀察結果。

2 結果

2.1 剖檢結果

經剖檢可見，雞只腳關節發炎腫脹充血，爪掌出現潰爛呈烏黑色痂，趾關節腫脹（如圖1）。

圖1 病變情況

2.2 分離菌的形態結果

分離所得菌株通過平板劃線細菌分離、單菌落純化后，得到的分離菌株在LB瓊脂培養基上為灰白色菌落，表面光滑、濕潤、圓形有隆起，革蘭氏染色呈藍紫色，無芽孢，葡萄狀菌落形態，初步鑒定為葡萄球菌。

2.3 分離菌PCR結果

對待檢分離菌以所提菌株DNA作為模板進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，通過與DNA Marker條帶對比（圖2），特異性DNA條帶約為1 500 bp，與預期目的基因大小相符，將純化的PCR產物外送測序，將序列在NCBI中進行Blast比對，確認分離株屬于葡萄球菌屬。

圖2 PCR鑒定

2.3 藥物敏感性結果

17種藥物試驗的敏感度結果如表2所示，分離得到的金黃色葡萄球菌株對萘啶酸、磺胺復合物、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星表現耐藥（R），對四環素、青霉素、氨芐西林表現中敏（I），對阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟均表現敏感（S）。

表2 藥敏試驗結果

3 結果與討論

金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性不斷提高，耐藥菌株日益增多，已被公認為家禽和人類健康面臨感染的最大威脅之一，也是一個重大的公共衛生問題。若發現該耐藥菌株引起的感染，應及時采取有力措施加以控制并加強耐藥性監測[2]。本研究采用了分子生物學鑒定方法，相較于傳統細菌鑒定方法簡單快速，通過基因序列同源性比較，能更準確的將不同的細菌區分開來。此次在雞病料中分離所得的1株致病性菌株通過革蘭氏染色鏡檢鑒定，結果顯示為革蘭氏陽性菌，呈藍紫色球狀菌，符合金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色特征。經細菌基因組DNA提取后進行PCR擴增，產物經凝膠成像系統得到清晰可見單一透亮的條帶，片段在1 500 bp左右，再通過測序所得序列在NCBI中進行Blast比對，確認分離株屬于葡萄球菌屬，為致病性金黃色葡萄球菌。

在本次藥敏試驗中，結果顯示該菌株對萘啶酸、磺胺復合物、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星表現耐藥（R），對四環素、青霉素、氨芐西林表現中敏（I），對阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟均表現敏感（S）。所以福建地區該養殖場在發病之后為達到控制效果，應選用敏感性較高的阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺復合物、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星等耐藥性藥物，以免造成抗生素泛濫使用以及增加養殖成本。養殖場在使用抗生素的過程中，注意交替用藥，不要一直使用單一抗生素，以免日后造成菌株新的耐藥性。

雞葡萄球菌的生物膜形成會在人體內引起感染，在家禽上雖然不是常見病和多發病，但一旦發病就特別嚴重[3]，它可引起畜禽各種化膿性疾病，如雞的華農性關節炎，牛科動物的急性或慢性乳腺炎，豬的流產和皮炎，馬屬動物的創傷感染、膿腫、蜂窩織炎等，對畜牧業危害巨大[4]。因它是體表的常在菌，在正常情況下，不會感染機體，但是當出現傷口時，比如注射疫苗、網刺、斷喙、扭傷和刮傷等都可以成為本病發生的誘因，另外，當由于長途運輸、室溫或氣溫變冷、改變飼養方式、通風不良、高溫高濕以及其他疾病的繼發性導致雞只受到應激或造成機體免疫力下降都可引發此病，雞葡萄球菌病的發生常常與飼養管理水平、飼養密度和環境潔凈度有直接關系，有關養殖場管理者應當做好預防工作，加強飼養管理，盡量減少或防止誘因的出現，保持雞群良好的精神狀態，雞舍應通風良好且有適宜的光照，維持合適的溫度和濕度，注意清除有可能導致雞外傷的因素，防止雞只因外傷增加感染此病的概率，防患于未然。

4 結論

（1）從福建地區該養殖場病料中分離所得菌株經鑒定為金黃色葡萄球菌。（2）通過藥敏試驗結果可知，該菌的耐受藥物為萘啶酸、磺胺復合物、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星，敏感藥物為阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟。（3）福建地區該養殖場在發病之后為達到控制效果，應選用敏感性較高的阿莫西林、鏈霉素、甲氧芐胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、磺胺甲惡唑、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟，避免使用萘啶酸、磺胺復合物、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星等耐藥性藥物。