高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中硝基咪唑類藥物殘留量

湯水粉，錢卓真，位紹紅，王麗娟

(福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

硝基咪唑類藥物含有5-硝基咪唑環結構，具有抗原蟲和抗菌活性，可用于防治滴蟲病、球蟲病以及六鞭蟲病等疾病[1-2]，深受養殖戶的青睞，在水產養殖中，硝基咪唑主要用于治療寄生蟲的感染，導致該類藥物在水產品中殘留[3]。由于硝基咪唑及其在生物體內的代謝產物具有潛在的致突變性和致癌性，如果在動物源性食品中殘留累積，則會對食品安全構成嚴重威脅[4-5]。因此，許多國家將硝基咪唑列為違禁藥物。我國已將這類藥物列入《食用動物禁用的獸藥及其他化合物清單(農業農村部公告第250號)》中。歐盟于1993年、1995年和1998年分別禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑這3種藥物用于食用動物；2002年美國食品與藥物管理局公布了在進口動物源性食品中禁止使用包括地美硝唑等硝基咪唑類藥物在內的共11種藥物[6]；我國食品中獸藥最高殘留限量標準規定的只能用于治療，但不得在動物性食品中檢出的藥物就包括甲硝唑和地美硝唑[7]。

目前，國內外用于水產品、獸產品等動物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測方法主要有酶聯免疫法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、氣相色譜法[13]和液相色譜-質譜聯用法等[14-15]。其中高效液相色譜-質譜聯用法因靈敏度高、選擇性和特異性好、操作簡單、能夠對低濃度的樣品進行很好的定性確認，而被廣泛應用于水產品中各類藥物殘留的檢測[16-17]。本研究在已有文獻和相關標準的基礎上，優化了前處理方法，采用乙酸乙酯提取、正己烷除脂，結合液相色譜-串聯質譜高度的選擇性和抗干擾能力，建立了水產品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的快速檢測方法。該方法的靈敏度高，實驗周期短，提高了工作效率。改進后的方法簡便、準確，能更好地滿足水產品中硝基咪唑及其代謝物檢測的要求，適合于大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用水產品均購自當地農貿市場、超市或養殖戶。樣品采回后取適量肌肉部分進行均質，所有基質樣品于-20℃冷凍保存，待用。

硝基咪唑類藥物標準品(德國Dr.Ehrenstorfer)，純度≥98%；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(美國Tedia)，色譜純；無水硫酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，分析純；實驗用水為Millipore Academic制備的超純水。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀(美國賽默飛世爾科技公司)；MS105電子分析天平、 ME203E/02電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿易有限公司)；MS3型旋渦混合器(德國IKA公司)；離心機(北京時代北利離心機有限公司)；旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)。

1.3 樣品前處理方法

稱取(5.00±0.05) g均質后的樣品，置于100 mL的塑料離心管，加入5 mL磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)，渦旋混勻。再加入30 mL乙酸乙酯和3 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩50 s，以3 500 r/min 離心5 min，將上清液轉入100 mL雞心瓶。殘渣加入20 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并提取液于100 mL雞心瓶。用旋轉蒸發儀于40℃水浴蒸干。準確加入1.0 mL 10%甲醇水溶液，渦旋振蕩溶解殘留物，再加入1 mL乙腈飽和正己烷渦旋混合30 s，以4 000 r/min離心5 min，取下層清液，經0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Hypersil Gold C18柱(100 mm × 2.1 mm，3.0 μm，美國 Thermo公司)；柱溫：30℃；

流動相：A為體積分數0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇；流速：0.250 mL/min。

流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子傳輸管溫度：350℃；噴霧電壓：3.0 kV；汽化溫度：200℃；鞘氣(氮氣)壓力：45 arb；輔助氣(氮氣)壓力：10 arb；碰撞氣(高純氬氣)壓力：1.5 mTorr。10種硝基咪唑類藥物的質譜參數見表2。

表 2 硝基咪唑類藥物及其代謝物的質譜參數Tab.2 MS parameters of nitroimidazoles and their metabolites

續表2

1.5 標準曲線繪制

準確稱取適量的每種硝基咪唑類藥物標準品，先用甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL標準儲備液。再用甲醇稀釋成濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑及其代謝物標準中間液。

根據每種硝基咪唑及其代謝物的靈敏度和線性范圍，分別吸取濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑標準中間液5.00～200 μL，配制成濃度為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL系列混合標準工作液，吸取10.0 μL進樣分析，以各組分的峰面積(Y)和相對應的質量濃度(X)進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.6 回收率與精密度

稱取(5.00±0.05)g勻漿后的樣品，分別加入一定量不同濃度的硝基咪唑類藥物標準溶液，然后按同樣的樣品前處理方法進行提取、凈化以及高效液相色譜-串聯質譜檢測，計算各種硝基咪唑藥物的回收率及相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的確定

2.1.1 質譜條件的優化

實驗采用蠕動泵，分別將10種硝基咪唑類藥物標準溶液(質量濃度均為1 μg/mL)以10 μL/min的流速注入電噴霧離子源，在ESI正離子模式下，對10種硝基咪唑藥物的質譜參數進行優化。選擇離子豐度最強的子離子作為定量離子，第二強的子離子作為定性離子。最后在選擇反應監測正離子模式下，再次優化碰撞能量等質譜參數。優化后硝基咪唑類藥物及其代謝物的質譜參數見表2，總離子流圖見圖1。

2.1.2 色譜條件的優化

硝基咪唑類藥物及其代謝物是一種中等極性化合物，已有文獻證實反相色譜柱更適合該類化合物的分離與檢測[18]。因此，實驗評估了Thermo Hypersil Gold C18柱和 Agilent ZORBAX SB-C18柱的分離效果，發現10種硝基咪唑類藥物在兩種色譜柱上均可實現較好的分離。但是使用Agilent ZORBAX SB-C18柱分離時，色譜峰拖尾，而采用 Thermo Hypersil Gold C18柱作為分析柱時，基線穩定，色譜峰拖尾較少，峰形更好。因此，實驗采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱作為分析柱。

由于硝基咪唑類藥物易溶于甲醇和乙腈，微溶于水，實驗選擇反相色譜常用的甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系，并在水相中加入0.1%甲酸促進離子化，研究其對分離效果和峰形的影響。結果發現，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相時，10種硝基咪唑類化合物的分離效果較差，而0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時，可以更好地提高檢測的靈敏度和分離效果，獲得理想的色譜峰。本文還研究了在0.1%甲酸水溶液中加入5.0 mmol/L乙酸銨對10種硝基咪唑類藥物分離效果的影響。結果顯示，當在流動相中加入一定量的乙酸銨后，部分目標物響應強度下降，而且色譜峰出現峰展寬的現象。因此本實驗選用甲酸水溶液-甲醇作為流動相。此時目標化合物能被較好地分離，其色譜圖見圖1。

綜上所述，本研究選用Thermo Hypersil Gold C18柱、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相對硝基咪唑藥物進行分離分析。

2.2 前處理方法的選擇

常用于提取動物組織內的硝基咪唑類藥物的溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等[18-20]，乙腈和甲醇雖然能提取硝基咪唑及其代謝物，而且能沉淀蛋白質，但是其也能與水混溶，會導致水溶性雜質較多，給后續的凈化與分析帶來干擾，加標回收率比較低；相比甲醇和乙腈，乙酸乙酯極性較低，在提取硝基咪唑類藥物的同時能減少水溶性雜質的溶出；而且硝基咪唑類藥物有一定的熱敏感性，如果在旋轉蒸發步驟中水浴溫度過高，將導致目標物的損失，因此在實驗過程中應盡可能選用沸點較低的有機溶劑，乙酸乙酯低沸點的特點可以彌補在旋轉蒸發步驟中過高的水浴溫度或過長的濃縮時間導致回收率偏低的缺點，更適合作為提取溶劑。因此實驗首先選用乙酸乙酯進行考察。因動物源性食品樣品含有大量的脂肪等雜質，提取液用正己烷脫脂。研究發現，乙酸乙酯溶劑對10種硝基咪唑類化合物的回收率可達70.0%～120%。考慮到硝基咪唑類藥物具有酸堿兩性性質，即在弱堿性條件下呈游離分子狀態，在弱酸性狀態下呈質子化狀態，因此提前在樣品中加入磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)預處理，使目標物以游離分子狀態存在，再加入乙酸乙酯進行提取。經比較發現，加入pH=8.0的弱堿性磷酸鹽緩沖溶液時，樣品回收率在70.0%～120%范圍內，且平行性比在中性狀態下提取的更好。

2.3 基質效應評估

由于水產品樣品基質復雜，常對待測物產生一定的基質效應。因此本研究用流動相和空白水產品樣品經提取后的定容液分別繪制系列濃度的硝基咪唑標準曲線，將兩種方法配制標準曲線的測定結果進行比較，即基質效應(%)=空白樣品提取液配制標準曲線的測定結果/流動相配制標準曲線的測定結果×100，以此評價樣品所產生的基質效應。結果顯示，在樣品基質中各種硝基咪唑類藥物的基質效應在86.8%～108%之間，結果見圖2?？梢姡洷痉椒ㄟM行前處理后10種硝基咪唑類藥物的基質效應均在可接受的范圍內。

2.4 線性關系和檢出限

在上述優化的色譜和質譜條件下，測得標準溶液色譜圖(圖1)。從圖中可知，在該優化條件下，各種硝基咪唑類藥物得到了很好的分離，且未發現雜質色譜峰的干擾。同時對序列濃度的標準溶液進行測定，以峰面積對硝基咪唑類藥物的質量濃度作線性回歸，得標準曲線(表3)。試驗結果表明，10種硝基咪唑類藥物線性關系良好，線性相關系數均大于0.995 0，說明該方法適用于硝基咪唑類藥物的定量分析。

表3 10種硝基咪唑類藥物的線性方程及相關系數Tab.3 Linear equations and correlation coefficients of ten nitroimidazoles

續表3

2.5 方法的靈敏度和回收率實驗

由于在液質聯用儀分析樣品的過程中，存在基質效應，以空白樣品進行加標處理后，在以信噪比(S/N)>3的前提下，求得10種硝基咪唑類藥物的檢出限為1.00 μg/kg。以不含硝基咪唑類藥物的空白樣品為研究對象，本實驗以魚肉為例，在樣品中分別加入1.00、2.00和5.00 μg/kg三個濃度水平的硝基咪唑類標準品，每個濃度做三個平行實驗，以考察方法的準確度和重現性，圖3為空白樣品和添加量為5.00 μg/kg的加標樣總離子流圖，加標回收率和精密度的實驗結果見表4?？芍?，在不同的加標濃度下，樣品的回收率均在70.2%～119.0%之間，相對標準偏均差(n=3)在13.5%以下。從試驗結果可以看出，該方法的準確度和精密度滿足水產品中硝基咪唑類藥物殘留量檢測的要求。

表4 魚肉加標樣的回收率和相對標準偏差Tab.4 Recoveries and RSDs for spiked fishes sample

2.6 實際樣品測定

采用本方法對本地區市售的鯉魚、草魚和鯽魚等共88份樣品進行了檢測，均未檢出硝基咪唑類藥物。相關部門應繼續加強水產品中硝基咪唑藥類物殘留量的監測，保障水產品的質量安全。

3 結論

本研究在相關文獻和標準的基礎上，采用高效液相色譜-串聯質譜法，通過對前處理條件和檢測條件的優化，實現水產品中10種硝基咪唑類藥物殘留的同時測定。實驗采用乙酸乙酯提取水產品中的硝基咪唑并用正己烷除脂，凈化后在液相色譜串聯質譜儀上檢測，以甲酸水溶液/甲醇作為流動相進行梯度洗脫，改善了硝基咪唑類藥物的響應值和峰形，提高檢測的靈敏度。

在本檢測條件下，10種硝基咪唑線性范圍為5.00～200 ng/mL。線性相關系數均大于0.995 0。對魚肉空白樣品進行10種硝基咪唑的加標實驗，加標量分別為1.00、2.00、5.00 μg/kg，回收率在70.2%～119%之間，相對標準偏均差(n=3)在13.5%以下。該檢測方法與原有的標準方法[20]相比，操作更簡便，靈敏度更高，適用于水產品中硝基咪唑類藥物的大批量檢測。