重金屬鎘、鋅、鉻對翹嘴鲌幼魚急性與聯合毒性效應試驗

母紅霞，李 蕾

(遼寧工程技術大學環境科學與工程學院，遼寧 阜新123000)

重金屬鎘(Cd)、鋅(Zn)、鉻(Cr)是水環境中的廣泛污染物。這些重金屬的存在對環境和生物均具有巨大的風險和危害[1-4]。生物監測能綜合反映環境污染狀況，可連續監測、發現早期環境污染且靈敏度高，同時其結果還是檢驗經去污處理后的水體適宜水生物生存最直接和有效的指標。魚類是水生態系統中的頂級捕食者，相比于其他低等水生生物，其對污染物毒性的富集更明顯。幼魚屬于魚類個體發育的早期階段，在這一階段中其對各種污染物的耐受力相對有限，因此將幼魚作為急性毒性試驗動物具有快速、靈敏、經濟有效等特點，而急性毒性試驗是生物測試保護天然水體的重要方法[5]。吳建紹等[6]利用高錳酸鉀等6種藥物對雙斑東方鲀(Fugubimaculatus)幼魚開展急性毒性試驗，評價了幼魚藥物耐受能力的強弱，同時得到藥物安全使用的控制量值。

翹嘴鲌(CulteralburnusBasilewsky)是我國重要的經濟魚類，地理分布廣泛，漁獲量大[7]。因此選擇翹嘴鲌進行毒性試驗，具有廣泛代表性，研究結果可以推廣至全國多數河流湖泊等水體。近年來，國內外不少學者研究重金屬對水生生物的毒性作用，如賈秀英等[8]研究了Cd和鉻(Cr，VI)單一及復合污染對鯽(Carassiusauratus)機體組織過氫化物酶同工酶的影響；趙守城[9]研究了鎘離子(Cd2+)、鉻離子(Cr2+)對大型水蚤(Daphniamagna)毒性的協同作用；Xu X M等[10]研究了鉛和百草枯對金魚(Carassiusauratus)肝臟解毒酶的聯合毒性。關于重金屬對魚類的影響大多集中于重金屬在魚體內的富集累積、遷移轉運等方面，為更加完善地保護水域環境、治理水體污染、保證水產品質量安全，仍需有針對性的毒性試驗來進行效應評估。本文通過研究重金屬Cd、Zn、Cr對翹嘴鲌幼魚的單一及聯合毒性效應，運用生物監測手段對水體的健康狀況進行評價，以期得到水體廣泛污染物對主要經濟魚類的安全濃度，為制定有害化學物質在水中的衛生標準及漁業用水水質標準提供量化依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

以翹嘴鲌為受試生物，選取1 200尾幼魚[平均體長為(3.6±0.5)cm，體重(0.42±0.16)g]，在實驗室水族箱中以試驗條件馴養7 d，適當投餌，并定期換水，保證水質條件良好。馴養期間需保證翹嘴鲌幼魚活動正常，體表無傷，死亡率低于5%。選用身體健康、反應靈敏、大小基本一致的幼魚隨機分組，進行毒性試驗。

1.2 試驗條件

試驗用水為曝氣3 d以上的自來水，溶解氧(DO)大于7 mg/L，pH 6.7～8.5，水體總硬度為2.2度(德國度)。試驗期間水溫保持(22±1)℃。試驗容器為30 cm×25 cm×20 cm的玻璃水缸，試驗缸中總水量為10 L，加水高度約為14.3 cm。每1個單一試驗小組(最小單元)使用上述試驗容器1套。

1.3 試驗試劑

氯化鎘(CdCl2)、硫酸鋅(ZnSO4)、重鉻酸鉀(K2Cr2O7)均為分析純，分別為毒性試驗提供重金屬離子Cd2+、鋅離子(Zn2+)和Cr6+。

1.4 單一急性毒性試驗

采用靜水生物測試法[11]進行單一急性毒性試驗。為確定Cd2+、Zn2+和Cr6+對所選取的特定體長、體重的翹嘴鲌幼魚作用的適當質量濃度，先預試驗，確定濃度范圍。當觀察到魚體呈仰翻或側傾姿勢漂浮于水面，喪失主動游動能力，且針刺無反應時，即判斷為魚體死亡[12]。

依據預試驗的試驗結果，單一急性毒性試驗按等比級數設置系列質量濃度組。其中，水體中的金屬離子濃度Cd2+為0、5.00、6.58、8.65、11.38、15.00 mg/L；Zn2+為0、20.00、25.20、31.70、39.90、50.00 mg/L；Cr6+為0、20.00、24.50、30.00、36.70、45.00 mg/L。濃度為0的組為空白對照組，每個質量濃度組設3個平行[13]。每1個單一試驗平行小組(最小單元)投放翹嘴鲌幼魚10尾，進行毒性試驗。在試驗開始的0～8 h內連續觀察翹嘴鲌幼魚的呼吸狀態、魚體傾角、游動行為等反應。記錄各組翹嘴鲌幼魚24 h、48 h、72 h和96 h的存活率，計算得到3種金屬離子對翹嘴鲌幼魚的半數致死濃度(LC50)和安全濃度。

1.5 聯合毒性作用試驗

將3種金屬離子兩兩組合，進行3組聯合毒性試驗。關于聯合毒性藥物的配比方法，修瑞琴等[14]提出按單一毒性最終LC50值進行毒性1∶1配比或質量濃度1∶1配比。因此本試驗的聯合毒性藥物采用單一毒性最終時長LC50進行毒性1∶1配比，即每一種重金屬96 h LC50的1/16、1/8、1/4、1/2和1。

1.6 數據處理

1.6.1 半數致死濃度(LC50)

在試驗毒物各濃度狀態下，將不同時長毒物處理后翹嘴鲌幼魚的剩余數量，轉換成存活率：

用24、48、72、96 h的試驗魚存活率對濃度作圖，選用存活率50%相鄰的兩個數據點應用直線內插法[11]，求出每種金屬離子在不同時間下的半數致死濃度(LC50)。

1.6.2 安全濃度

計算安全濃度(SC)的方法有兩種，分別是公式Ⅰ：SCⅠ=48 h LC50×0.3/(24 h LC50×48 h LC50)2和公式Ⅱ：SCⅡ=96 h LC50×0.1。這兩種計算安全濃度的方法都具有一定的科學依據，但在數值上，SCⅠ≈3×SCⅡ。相較于SCⅠ，SCⅡ在判定毒物的毒性上更為嚴格和安全。因此，本試驗采取公式Ⅱ計算安全濃度。

1.6.3 聯合毒性評價

運用水生毒理聯合效應Marking指數相加法[14]評價聯合毒性。

S=(AmBm/An)+(AmBm/Bn)

(1)

式(1)中：A、B 為二種不同毒物；An、Bn分別為A、B二種毒物單獨作用時的LC50值；AmBm為A、B二種毒物聯合作用時的LC50值。

用加和指數AI值判定多種毒物共同發揮作用時所產生的效應。由毒物單獨作用、聯合作用時的LC50值，依式(1)計算得到S值。當S≤1時，AI=1/S-1；當S>1時，AI=1-S。由S值計算得到AI值，并依據AI值判定聯合毒性效應。若AI>0，則表明多種毒物聯合的效應為協同作用；AI<0時表明毒物聯合效應為拮抗作用；AI=0則表明毒物聯合效應為相加作用。

2 結果

2.1 單一急性毒性

2.1.1 幼魚中毒癥狀

圖1所示為翹嘴鲌幼魚受重金屬離子Cd2+、Zn2+、Cr6+脅迫中毒與自然死亡的癥狀對比。

如圖1所示，死亡魚體表面均有明顯傷口。體表傷口差別顯著：自然死亡的魚體傷口沒有顏色；鎘中毒死亡魚體體表傷口為黑色；鋅中毒死亡魚體全身白色且內臟從傷口處可見；鉻中毒魚體傷口為紅色，全身部分充血。

1)鎘：Cd2+對翹嘴鲌幼魚的毒性作用較慢。當幼魚放入試驗水體時，其游動速度略有加快；較短時間后濃度低于8.65 mg/L的3個試驗組內的幼魚活動均趨于平靜。8 h后11.38 mg/L試驗組中的幼魚開始出現不適癥狀，游動失去平衡并且開始出現死亡。死亡個體體表出現較大區域破潰傷口，傷口顏色呈黑色，體表腐爛，附有白色沉淀物。

2)鋅：翹嘴鲌幼魚的Zn2+中毒癥狀，以濃度25.20 mg/L試驗組為例：4 h后部分幼魚體表開始出現破潰星點，但仍可生存、無死亡。隨時間推移，幼魚出現興奮狀態，急躁不安，游動加快，于上下不同水層之間急速竄動，并且伴有撞壁和側翻表現；24 h后游動十分緩慢，出現個體死亡；48 h后幼魚基本不游動，80%試驗幼魚體表分泌大量黏液，以魚鰭和魚尾最為嚴重，黏膜遭到破壞，鰓有腐蝕，體表附著棉絮狀白色物質；96 h后絕大部分幼魚體表充血，并且水體表面附著油狀薄膜物質，透明度降低，水體發臭。

3)鉻：Cr6+對翹嘴鲌幼魚的毒性作用較快，在濃度36.7 mg/L試驗組中，處理20 min后部分幼魚體表分泌黏性物質；而在最大濃度45.0 mg/L組內的幼魚，初期即出現狂躁興奮、加速游動等表現，短時間內開始失去平衡、打轉、痙攣；Cr6+處理1 h開始出現死亡現象，死亡個體頭部、尾部明顯發黑，呈現彎曲體狀。

2.1.2 系列濃度下的幼魚存活率

由系列濃度在不同時間下的存活率結果如圖2～4所示。由圖2可知，當Cd2+為5.00 mg/L時，各個時間節點幼魚總體維持較高的存活率，均≥70%；隨著試驗濃度的逐步提高，濃度自6.58 mg/L 升至11.38 mg/L區間范圍，試驗幼魚存活率開始呈現急速下降；當Cd2+達到15.0 mg/L時，24 h和48 h時幼魚存活率已分別降至20%和10%的極低水平，72 h時全部死亡。

注：0為對照組。下圖同此。Notes：0 was control group.The same as below.

從圖3可見，當Zn2+為低濃度20.00 mg/L時，各個時間點存活率相對較高，均≥65%；在20.20 mg/L、31.70 mg/L兩濃度組區間，24 h和48 h的存活率下降較平緩，而毒物脅迫時長在72 h及以上時出現陡降。在Zn2+為50.00 mg/L時，試驗開始短時間內即出現大量死亡；未達72 h已無一存活。

圖4所示，當Cr6+為20.00 mg/L時，試驗全程至96 h均有絕大多數的幼魚存活，存活率≥85%；隨著試驗濃度的逐步提高，在24.50 ～36.70 mg/L濃度范圍內試驗幼魚存活率驟降，其中以30.00 mg/L、36.70 mg/L兩組表現最為劇烈；當Cr6+達到45.00 mg/L時，24 h和48 h時幼魚存活率已分別降至20%、5%，未及72 h存活率均為0%。

2.1.3 LC50及安全濃度

使用直線內插法，分別計算單一急性毒性3種金屬離子對翹嘴鲌幼魚的24 h、48 h、72 h和96 h的半數致死濃度(LC50)，再用公式Ⅱ：SC=96 h LC50×0.1計算出安全濃度，結果如表1所示。由圖2～4及表1可得，Cd2+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為12.29、9.56、7.41、6.05 mg/L；Zn2+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為41.92、34.43、27.37、22.23 mg/L；Cr6+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為39.47、32.68、27.25、25.72 mg/L。3種重金屬對翹嘴鲌幼魚的安全濃度分別為0.605、2.223、2.572 mg/L。

表1 Cd2+，Zn2+和Cr6+對翹嘴鲌單一毒性試驗結果Tab.1 Single toxicity experiment results of Cd2+，Zn2+and Cr6+

2.2 聯合毒性

2.2.1 過程觀察

觀察聯合毒性試驗過程，在Cd2+/Zn2+、Zn2+/Cr6+、Cd2+/Cr6+三種組合的毒物脅迫條件下，毒物處理4 h后，[Cd2+(1.51 mg/L)/Zn2+(5.56 mg/L)]共同作用下的翹嘴鲌幼魚開始出現死亡；在連續觀察8 h后， [Zn2+(2.78 mg/L)/ Cr6+(3.22 mg/L)]、[Cd2+(1.51 mg/L)/ Cr6+(6.43 mg/L)]試驗組中的翹嘴鲌幼魚也開始出現死亡。而脅迫濃度較低的[Cd2+(0.38 mg/L)/Zn2+(1.39 mg/L)]、[Cd2+(0.76 mg/L)/Zn2+(2.78 mg/L)]、[Zn2+(1.39 mg/L)/ Cr6+(1.61 mg/L)]、[Cd2+(0.38 mg/L)/ Cr6+(1.61 mg/L)]、[Cd2+(0.76 mg/L)/ Cr6+(3.22 mg/L)]試驗組幼魚在經20 h以上毒物聯合作用后開始表現出身體傾斜、游動失去平衡等中毒現象，但存活率普遍維持在較高水平，均高于60%。

2.2.2 存活率

隨著各金屬離子濃度的升高和重金屬脅迫時間的不斷推移，每二者組合對翹嘴鲌幼魚的聯合毒性逐漸增強，尤以Zn2+/Cr6+聯合中的兩高濃度組[Zn2+(11.12 mg/L)/ Cr6+(12.86 mg/L)]、[Zn2+(22.23 mg/L)/ Cr6+(25.72 mg/L)]和Cd2+/Zn2+聯合中的最高濃度組 [Cd2+(6.05 mg/L)/Zn2+(22.23 mg/L)]最為劇烈；這一規律可以從幼魚存活率顯著降低得到直觀表現(表2)。

表2 Cd2+，Zn2+和Cr6+對翹嘴鲌聯合毒性下的存活率Tab.2 Survival rate of larva under the Cd2+，Zn2+and Cr6+ joint toxicity

2.2.3 半數致死濃度(LC50)

隨著聯合試驗時間的延長，各組合的聯合毒性不斷增強，LC50下降趨勢明顯(表3)。 Cd2+/Zn2+聯合作用時，自24 h至48 h，LC50微幅下降；48 h至96 h之間，LC50表現出規律性的近半跌幅。Zn2+/Cr6+聯合作用時，自24 h至72 h，LC50呈現出隨時間推移的均勻降低；72 h至96 h，降幅趨緩，變動不大。Cd2+/Cr6+聯合作用下，自24 h至48 h，LC50出現接近減半的陡降；自48 h至72 h，LC50降幅極??；而自72 h至96 h，LC50值再次出現降幅超過一半的大幅降低。

表3 聯合毒性半數致死濃度Tab.3 Each LC50 of Cd2+，Zn2+，Cr6+ in joint toxicity test

2.2.4 聯合作用

根據表2、表3數據，運用水生毒理聯合效應Marking指數相加法[14]，進行3種重金屬兩兩組合的聯合毒性效應評價(表4)。由表4可知，Cd2+/Zn2+、Zn2+/Cr6+、Cd2+/Cr6+共存24 h、48 h、72 h、96 h的AI值均大于0，指征各組合的聯合毒性均表現為協同作用，即2種重金屬離子共存時毒性明顯加強。該結論不僅從計算出的AI值上得以判斷，而且對比表1與表3中的LC50也可知，在聯合作用下每種金屬離子的LC50相較于單獨毒性均出現大幅下降。毒物水平遠低于單一脅迫時的 LC50(表1)即導致試驗幼魚半數死亡，表明聯合毒性增強。

表4 三種重金屬兩兩聯合毒性評價Tab.4 Joint toxicity effect of the Cd2+/Zn2+/Cr6+

3 討論

3.1 單一急性毒性

根據魚類急性中毒試驗的96 h LC50，可以將有毒物質對魚類的毒性作用分為4級[11]，分別為劇毒(有毒物質的質量濃度< 0.1 mg/L)、高毒(0.1～1.0 mg/L)、中毒(1.0～10.0 mg/L)、低毒(>10.0 mg/L)。我國GB 11607—1989《漁業水質標準》對Cd、Zn、Cr的最高容許質量濃度分別為0.005 mg/L、0.1 mg/L、0.1 mg/L。

鎘：Cd是一種對動物體毒性較強的重金屬。關于其強毒機理，Pragati N K等[15]的最新動物試驗表明，膳食鎘通過誘導生物體血細胞凋亡，從而降低血細胞水平。本試驗測得Cd2+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為12.29、9.56、7.41、6.05 mg/L；安全質量濃度為0.605 mg/L，高于我國漁業水質標準。根據毒性標準，判斷Cd2+對于翹嘴鲌幼魚屬中毒物質。根據曾艷藝等[16]開展的Cd2+對珠江水域天然仔魚及幼魚的毒性效應及其潛在生態風險評估，Cd2+對赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)仔魚(48 h)、鲴(Xenocyprissp.)仔魚(48 h)、廣東魴(Megalobramaterminalis)幼魚(96 h)的LC50分別為1.29、0.83、3.20 mg/L，安全濃度分別為0.163、0.077、0.320 mg/L，均顯著低于本試驗得到的LC50和安全濃度，說明受試對象翹嘴鲌幼魚相較于廣東魴幼魚等對Cd2+的耐受能力更強。

鋅：Zn是動物體的必需微量元素，但過量的鋅則會對機體造成危害。為探究Zn對魚類的致毒機理，Si L F等[17]研究環境中Zn2+對斑馬魚的非免疫性滯后影響，揭示出Zn2+通過參與酶組成以及改變非酶分子的形態作用于魚體免疫代謝。本試驗得到Zn2+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為41.92、34.43、27.37、22.23 mg/L，判定為低毒物質，翹嘴鲌幼魚對Zn2+的耐受性較強，安全濃度為2.223 mg/L，高于我國漁業水質標準。王瑞龍等[18]在對唐魚(Tanichthysalbonubes)的急性毒性及安全濃度評價研究中，得到Zn2+對唐魚的24、48、72、96 h的LC50分別為35.43、26.53、20.66、16.30 mg/L，低于本試驗得到的LC50，可見翹嘴鲌對Zn2+擁有更高的耐受性。

鉻：本研究中，Cr6+中毒死亡幼魚普遍呈現魚體彎曲、頭尾發黑明顯。這一突出現象與陳細香等[19]解剖Cr6+中毒死亡的黃鱔(MonopterusalbusZuieuw)所述現象一致，該研究發現遍布魚體最突出的癥狀表現為淤血，集中部位包括鰓絲、各鰭、腸壁和內臟。 目前普遍認為Cr6+引起其他生物中毒的機制是導致蛋白變性，使酶失活，從而干擾代謝[20]。Elena V N等[21]通過對廢水營養物質回收流入海水養殖設施的試驗，證實Cr6+對水生生物的毒性普遍較小。這與本試驗所得翹嘴鲌對Cr6+的耐受性較高的結論相符合。本試驗中Cr6+的24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為39.47、32.68、27.25、25.72 mg/L，安全濃度達2.572 mg/L，高于我國漁業水質標準。吳賢漢等[22]對青島文昌魚(Branchiostomatsingdauertse)進行毒性與生長關系的研究，發現微量的Cr6+能夠促進魚類的生長發育。劉銀華等[23]的研究也表明，Cr6+對黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬低毒物質，黃顙魚“全雄1號”苗種24、48、72、96 h的 LC50分別為168.71、84.85、52.23、34.46 mg/L，安全濃度達3.446 mg/L，其耐受性高于本試驗受試對象翹嘴鲌幼魚。

本試驗的3種重金屬中，Cd2+對翹嘴鲌的致死毒性最大，毒性大小順序依次為Cd2+> Zn2+> Cr6+。吳賢漢等[22]、李健[24]的研究證明，該毒性規律也出現于青島文昌魚、南方鲇(SilurusmeridionalisChen)中。同時，也有研究表明，魚類在不同生長階段對重金屬的毒性反應并不一致。如吳玉霖等[25]證明重金屬對牙鲆胚胎毒性順序依次為Cu2+> Zn2+> Cd2+> Cr6+，對牙鲆幼魚毒性大小的順序為Cu2+> Cd2+> Zn2+> Cr6。

3.2 聯合毒性評價

Zn2+/Cr6+共存時的AI值大于Cd2+/Zn2+共存、Cd2+/Cr6+共存，說明Zn2+/Cr6+共存時的協同作用較其他兩組更加明顯。這一點從該組試驗魚存活率較之另兩組明顯下降中得到直觀驗證。張云龍等[26]對鯽仔魚的研究得出同樣的結論，Zn2+/Cr6+二種離子共存時毒性明顯加強。Cd2+/Cr6+共存時的AI值大于0，聯合毒性表現為協同作用，這與王少博等[27]對草魚苗的毒性試驗結論相同，即Cd2+/Cr6+共同作用比二者各自毒性的簡單加和更強烈。

關于如何評價混合物質的聯合毒性，Eaton J G[28]在1973年利用Cd與Zn的混合溶液進行毒性試驗，提出多種毒物共存的聯合毒性作用復雜，不能采用單獨毒性直接加和的方法評價。Speher R L等[29]通過對美國旗魚(Jordanellafloridiae)的研究，進一步證實Cd、Zn共同作用下的聯合毒性遠大于二者單獨毒性的相加之和。陳亮等[30]經過研究也得到重金屬在聯合作用時能夠表現出不同的毒性影響的結論。而國際上并沒有統一的聯合毒性藥物的配比方法標準，修瑞琴等[14]提出按單一毒性最終時長LC50值進行毒性1∶1或質量濃度1∶1最為簡便，這亦是本試驗所采用的毒性1∶1的試驗方法。

本試驗研究結果對漁業用水水質環境中廣布類重金屬的安全性評價具有一定的指導意義，同時也可為毒理學研究提供基礎依據。毒性效應影響因素多，包括溫度、鹽度、pH值、有機質等理化因素，而在實際魚類生存環境評價中更需要綜合考慮影響因素，并科學合理地制定相關建議方法。加之多種物質混合后的機理復雜，往往呈現出多元綜合效應，這為今后進一步探究提供新方向。