菊花含量測(cè)定方法提高

王小芳 鄭倩倩 路麗娟

石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050011

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序。具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[1]。藥理研究[2-3]表明菊花具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等藥理作用，其主要成分為黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等。

該品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為2020版《中國(guó)藥典》，含量測(cè)定以綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸3個(gè)成分作為其質(zhì)控成分，采用高效液相色譜法，以乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫。但在日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用藥典方法測(cè)定含量時(shí)3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸與其同分異構(gòu)體1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸不能有效分離，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果偏差較大，不能真實(shí)反應(yīng)該成分含量，需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)。雖然近年來(lái)關(guān)于菊花多成分測(cè)定的報(bào)道較多[4-11]，但并未檢索到能將二者有效分離的高效液相色譜方法。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)菊花含量測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)改變流動(dòng)相對(duì)色譜條件進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的有效分離，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ARC高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；CPA225D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；Elmasonic P 超聲波清洗儀(德國(guó)Elma公司)；水浴鍋(天津泰斯特)。

1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201716，純度以99.3%計(jì))、木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)：111720-201408，純度以94.8%計(jì))、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品(批號(hào)：111782-201706，純度以97.3%計(jì))均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號(hào)：E-0447-18042523，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)。乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均為色譜純；水為超純水。4批菊花(購(gòu)自市場(chǎng))經(jīng)本中心畢飛霞老師鑒定為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，樣品1為杭白菊、樣品2～4為貢菊。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 試驗(yàn)Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脫，程序見(jiàn)表1，檢測(cè)波長(zhǎng)為348 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫表

本方法，綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸各峰的理論板數(shù)均大于10000，分離度均大于1.5。本方法和藥典方法條件下，對(duì)照品和供試品色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液和混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對(duì)照品適量，加70%甲醇分別制成含綠原酸1.5729 mg/mL、木犀草苷1.5744 mg/mL、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸1.9499 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液各1 mL，用70%甲醇定容至25 mL，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取菊花粉末(過(guò)一號(hào)篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置5、10、25、50 mL量瓶、2 mL置250 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得稀釋5、10、25、50、125倍的5 個(gè)濃度梯度的線性考察混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.2 精密度考察 取2.3.3項(xiàng)下制備的樣品溶液1份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積，測(cè)得綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD值分別為0.85%、0.44%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一批供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得6份樣品中綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量的RSD值分別為0.64%、1.41%、1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批供試品約0.125 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入各對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取2.3.3項(xiàng)下制備的樣品溶液1份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0、2、6、8、16、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算3種成分峰面積的RSD值，綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量的RSD值分別為1.25%、0.66%、0.55%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.6 色譜柱耐用性試驗(yàn) 取同一批樣品，照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對(duì)不同品牌色譜柱的耐用性進(jìn)行考察，并計(jì)算含量。其中Agilent 5Tc-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱在2.1色譜條件下木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的分離度均小于1.5。TechMate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)系統(tǒng)適用性較好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同品牌色譜柱耐用性結(jié)果

2.3.7 樣品的測(cè)定 按2.2.2項(xiàng)下方法，制備4批菊花供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件和藥典方法分別進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積，按干燥品計(jì)算樣品中綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果(%)對(duì)比表 (n=3)

3 討論

3.1 分析條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中首先選用了3種不同品牌色譜柱Agilent 5Tc-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm)、TechMate C18-ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在藥典方法乙腈-0.1%磷酸溶液的基礎(chǔ)上調(diào)整流動(dòng)相比例，但3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸均重合在一起，無(wú)法分離。之后改變流動(dòng)相組成，采用甲醇-磷酸溶液[2]系統(tǒng)，可使3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸分離度大于1.5，但木犀草苷分離度小于1.5。后又試驗(yàn)了乙腈-甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)和乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸[4-5]系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)，乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脫各成分分離度較好，綠原酸、木犀草苷，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸分離度均大于1.5，最終選擇該系統(tǒng)梯度洗脫。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)掃描200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的最大吸收分別為326.1、348.8、327.3 nm，綠原酸和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸在327 nm與348 nm處的峰面積比接近1.8，木犀草苷在327 nm與348 nm處的峰面積比接近0.8，如果檢測(cè)波長(zhǎng)選擇327 nm對(duì)3種成分峰面積影響較小，但是由于木犀草苷的含量較低，峰面積較小，對(duì)其準(zhǔn)確度影響較大，因此本方法還是采用藥典方法的348 nm。

3.3 2020版《中國(guó)藥典》菊花含量測(cè)定 方法中3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸與1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸不僅出峰時(shí)間一致，且二者混合物的紫外吸收與3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸也完全一致(如圖2所示)，在日常檢驗(yàn)中很容易誤判，造成檢驗(yàn)結(jié)果的誤差。藥典菊花中3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的限度為不得少于0.70%，由樣品測(cè)定結(jié)果可以看出，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量前后相差較大，有的甚至?xí)绊懫涫欠窈细竦呐卸āＯ啾人幍浞椒ǎ痉椒ń鉀Q了3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的分離問(wèn)題，檢測(cè)結(jié)果更加可靠。

本實(shí)驗(yàn)采用的新方法能較好的分離菊花中的綠原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，重現(xiàn)性好，解決了現(xiàn)行方法3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸與1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸不能分離的問(wèn)題，可作為該品種含量方法改進(jìn)的參考。