天然冰片微乳凝膠的制備及其質量評價

葉小玲 趙 瑩 王 楠 張聲源,3 賴澤佳 袁麗婷 聶 華,3*

1.嘉應學院醫學院，廣東 梅州 514031；2.嘉應學院/廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514031；3.嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所，廣東 梅州 514031

天然冰片是一味重要的中藥，具有清熱止痛、防腐生肌、抗菌消炎的作用[1]，臨床上可用于治療燒燙傷、皮膚瘙癢癥[2]等疾病，因此，在外用制劑中應用廣泛。但由于天然冰片在水中幾乎不溶，且易升華，影響了它的療效和研究開發。近年來，微乳凝膠以其良好的生物相容性、無毒、增溶和促進藥物透皮吸收[3]、對藥物分散性好、穩定性高、維持血藥濃度[4]等特性引起人們的高度重視。因此，本實驗以微乳凝膠為載體包裹天然冰片，以期提高天然冰片的溶解度和生物利用度，增加制劑穩定性，最終提高藥物療效。

1 材料

1.1 儀器 FA2004電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，金壇市新航儀器廠；pH酸度計，南京科環分析儀器有限公司； UV-7504單束光紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；粒徑測定儀，美國產；氣相色譜儀(日本島津GC-14B/FID)；Viscolead One 黏度計,紡吉萊博(Fungilab)科技(北京)有限公司；TG16-WS高速離心機，上海趙迪生物科技有限公司；XMTD-8222電熱恒溫鼓風干燥箱；JP-100S超聲波清潔器，深圳市潔盟清洗設備有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司。

1.2 藥物與試劑 天然冰片(自制，含右旋龍腦98.0%)；肉豆蔻異丙酯(批號11606023)、聚氧乙烯蓖麻油EL(批號C1812053)、曲拉通X-100(批號D1728071)、油酸乙酯(批號B1626080)均購自阿拉丁試劑有限公司；1,2-丙二醇(批號049795001430)，美國陶氏；卡波姆-940(批號20170625)、蓖麻油(批號20170911)、橄欖油(批號20170501)，河南省龍華藥業有限公司；吐溫-80(批號20170608)，天津市大茂化學試劑廠；三乙醇胺(批號201810)，天津市廣成化學試劑有限公司；甘油(批號20171201)，南昌華鑫醫藥化工有限公司；乙酸乙酯(批號20190117)，西隴科學股份有限公司；水為超純水；其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 天然冰片的提取[5-6]稱取梅州產香樟樹葉150 g，水蒸氣蒸餾3.5 h，收集餾出物后，加入過量的無水硫酸鈉充分振蕩，靜置20 min；使用循環水式真空泵抽濾裝置，對混合物進行抽濾，所得不含水分透明液體置于蒸發皿中，升華純化得白色晶體。稱量、計算天然冰片的得率。天然冰片平均得率為1.34%。

2.2 天然冰片微乳的處方篩選與優化

2.2.1 微乳的制備[7]稱取適量的天然冰片加入到油相中、加入適量的乳化劑和助乳化劑，水浴加熱，攪拌均勻至完全溶解，得淡黃色澄清透明的油相混合物，置于恒溫磁力攪拌下，采用水滴加入法，緩緩地將水滴入該油相混合物中乳化，即得微乳。

2.2.2 油相、乳化劑、助乳化劑的配伍試驗 分別以蓖麻油、油酸乙酯、橄欖油、肉豆蔻酸異丙酯為油相，以聚氧乙烯蓖麻油(EL-35)、曲拉通X-100、吐溫-80為乳化劑，以1，2-丙二醇、PEG-400為助乳化劑，將油相、乳化劑與助乳化劑以1∶4∶1的比例混合，在磁力攪拌器攪拌下，加入50 mL的水，以成乳后的溶液狀態、色澤等為指標考察乳化情況，結果見表1。經過不同油相和乳化劑、助乳化劑的組合配伍實驗得知，以橄欖油和油酸乙酯為油相的組合，所得溶液幾乎為白色乳液，并且放置后出現分層現象；以吐溫80為乳化劑的組合，所得溶液澄清，微透明，無乳光，放置出現分層現象；而曲拉通X-100為乳化劑的組合，雖能得到澄清透明并帶乳光的溶液，但得到的溶液放置易分層；以PEG400為助乳化劑的組合，所得的溶液大多為微澄清，不透明。故這五種輔料的配伍組合不適于作為微乳的輔料。從表1中的數據可知，以蓖麻油、肉豆蔻酸異丙酯為油相，以聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑，1,2-丙二醇為助乳化劑組合所得的微乳澄明度較好，有乳光，且15000 r·min-1離心30 min后無分層，常溫避光靜置1周后微乳穩定。

表1 不同油相和乳化劑、助乳化劑的配伍實驗結果

2.2.3 偽三元相圖的繪制 根據配伍試驗結果，分別稱取適量蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和1,2-丙二醇；IPM、聚氧乙烯蓖麻油和1,2-丙二醇，首先按乳化劑與助乳化劑的質量比(Km)=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、1∶9配制一系列乳化劑與助乳化劑混合物，再將各混合物與油相分別以 9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、1∶9的質量比混合，固定體系總質量為1.0 g，30 ℃水浴加熱溶解，攪拌均勻得油相混合物。于恒溫磁力攪拌下，分別將該油相混合物滴入50 mL水中乳化，并進行外觀評價，篩選出外觀澄清藍色溶液或藍白色溶液的處方。采用Origin 2017版軟件繪制蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和1,2-丙二醇；IPM、聚氧乙烯蓖麻油和1,2-丙二醇偽三元相圖，確定微乳區域，如圖1所示。由相圖結果可知，圖1-A微乳區域面積最大，在此區域內乳化效果較好。結合配伍試驗與偽三元相圖結果，篩選蓖麻油為油相，聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑，1,2-丙二醇為助乳化劑，且選擇載油量最大、乳化劑用量相對少的處方為最優處方。因此，確定蓖麻油-聚氧乙烯蓖麻油-1,2-丙二醇質量比為2∶5∶1。

圖1 香樟揮發油微乳偽三元相圖

2.3 天然冰片微乳的制備工藝考察

2.3.1 乳化溫度的選擇 按質量比為2∶5∶1分別精密稱取聚氧乙烯蓖麻油0.3125 g，1,2-丙二醇0.0625 g，蓖麻油0.125 g，總量為0.5 g，加入0.0764 g天然冰片，置于水浴加熱充分攪拌至溶解，得淡黃色清澈透明的混合油相，將該油相置于乳化溫度分別為30、40、50、60 ℃，轉速為150 r·min-1恒溫磁力攪拌下，向其逐滴滴入 25 mL 水充分乳化。通過研究比較在不同溫度下所制成的微乳液外觀，透光率(紫外可見分光光度計法：稱取樣品0.1 g，加水稀釋并定容至10 mL，以水為空白對照，在430 nm處測定)來探究溫度對天然冰片微乳制備的影響，結果見表2。隨著溫度的升高，天然冰片微乳的透光率越來越低，即所得的微乳粒徑越來越大，綜合評價各評價指標值確定最適宜的乳化溫度為30 ℃，在該溫度下，所得微乳的粒徑最小，澄清透明有藍光。

表2 乳化溫度對乳化效果的影響 (n=3)

2.3.2 稀釋倍數的確定 按質量比為2∶5∶1分別精密稱取聚氧乙烯蓖麻油0.3125 g，1,2-丙二醇0.0625 g，蓖麻油0.125 g，總量為0.5 g，加入0.0764 g天然冰片，水浴加熱，充分攪拌溶解，得到油相混合物，將恒溫磁力攪拌器的溫度調至2.3.1項下確定的最佳乳化溫度，轉速為150 r·min-1，分別緩慢滴入1.25、2.5、5、10、15、25 mL水進行乳化，制備形成微乳。通過研究比較所制成的微乳外觀性狀與透光率(紫外可見分光光度計法：稱取樣品0.1 g，加水稀釋并定容至10 mL，以水為空白對照，在430 nm處測定)兩個主要篩選指標，確定適宜的稀釋倍數。結果見表3。隨稀釋倍數的增大，微乳的透光率也隨著增大，即粒徑也隨著變小。當水≥1.25 mL，即稀釋倍數≥10倍時，均能形成澄清透明淡藍色天然冰片微乳，透光率均>80%，常溫靜置24 h微乳的仍穩定。因此，選擇油水的質量比為1∶10。

表3 稀釋倍數對乳化效果的影響

2.4 單因素考察空白凝膠處方

2.4.1 凝膠的制備 稱取適量卡波姆-940，加入適量甘油潤濕，加水至25 g，充分攪拌均勻，靜置24 h，使凝膠基質得到充分溶脹，加入體積分數為20%三乙醇胺溶液，對凝膠基質的pH進行調節，于離心機中以5000 r·min-1離心5 min脫氣，即得。

2.4.2 卡波姆-940用量的篩選 稱取適量卡波姆-940粉末，加水至25 g，攪拌均勻，靜置24 h使其充分溶脹，以凝膠基質的的外觀性狀、黏稠程度、涂抹性能和黏度[(25±2)℃，4號轉子，轉速為12 r/min]為評價指標，探究卡波姆-940用量分別為0.3%、0.5%、0.8%、1.1%、1.3%、1.5%對凝膠的影響。其中，外觀包括凝膠的澄清透明度，有無光澤，有無沉淀等。涂展性分為輕質-快速鋪展、中質-慢速鋪展與厚質-難以鋪展[3]，卡波姆-940用量的篩選結果見表4，當卡波姆的用量范圍在0.8%～1.2%時，凝膠的外觀澄清透明，均勻細膩，黏稠度適中且涂展性良好。

表4 卡波姆-940用量的篩選結果

2.4.3 甘油用量的篩選 稱取卡波姆0.15 g，分別加入5%、8%、10%、12%、15%的甘油潤濕，加水至25 g，攪拌均勻，靜置24 h使其充分溶脹，以凝膠的外觀、粘稠度、油膩感、涂抹性能、黏度與保濕率作為評價指標，考察甘油的用量范圍，結果見表5。研究發現凝膠的粘稠度隨甘油的用量的增加而增大，當甘油用量≥10%時，油膩性，粘稠度，涂展性越來越強，降低了凝膠的質感，保濕性差異不明顯。當甘油用量為5%～8%時，凝膠的粘稠度適中，不油膩，容易涂展。因此，選擇甘油的用量范圍為5%～8%。

表5 甘油用量的篩選結果

2.4.4 pH值的篩選 稱取卡波姆0.15 g，甘油0.95 g潤濕，加水至25 g，攪拌均勻，靜置24 h，使凝膠基質得到充分溶脹，加入20%三乙醇胺溶液調節凝膠基質的pH分別至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以凝膠的外觀性狀、粘稠度、成型效果、涂抹性能和黏度為篩選指標，研究出pH的用量范圍，結果見表6。研究發現，凝膠的粘稠度隨pH的增大而增大。當調節pH為4.0時，很容易涂展，粘稠度較低，流動性也較強，不符合凝膠劑的要求，當調節pH值為7.0時，過于粘稠，涂展性能較差，出現結團現象，也不符合凝膠劑的要求。因此，確定凝膠的pH范圍為5.0～6.0。

表6 pH值的篩選結果

2.4.5 正交設計優化凝膠處方 由單因素篩選結果，初步得出了空白凝膠的配方組成及其各成分的用量范圍：卡波姆-940用量X1%～X2%，甘油用量Y1%～Y2%，20%體積分數三乙醇胺溶液調節pH值Z1～Z2。設計卡波姆-940的質量(A)、甘油的質量(B)、pH值(C)為篩選因子，并且為每個因子選擇3個水平，采用L9(34)因素水平表進行正交設計試驗，以空白凝膠基質外觀、粘稠度、油膩性與涂抹性能，保濕率為標準進行評價，每個標準各占20分，計算出綜合評分進行比較，篩選空白凝膠最佳組成和比例。正交設計因素水平及結果見表7，方差分析結果見表8。

根據表7結果，選擇直觀分析方法，通過對正交設計的結果進行極差比較分析，得出空白凝膠的影響因素依次為A(卡波姆-940用量)>C(pH值)>B(甘油用量)，即卡波姆-940用量對凝膠基質的影響最大，其次是pH值的影響，甘油用量對凝膠基質的影響最小。由正交設計結果可以篩選出最優凝膠基質處方為A1B1C1。根據凝膠處方篩選的方差分析可得，卡波姆-940和甘油的處方用量，與pH值三者的F值均<19.00(表8)，表明3者對凝膠基質處方的綜合評分都無顯著性影響(P>0.05)。因此，可以得出空白凝膠基質的最佳處方為A1B1C1，即0.8%卡波姆、5%甘油、調節pH值為5.1。

表7 凝膠處方篩選的 L9(34) 正交設計結果

表8 凝膠處方篩選方差分析

2.5 天然冰片微乳凝膠的制備 根據配伍試驗與偽三元相圖篩選并優化處方，結合制備工藝考察及凝膠處方篩選方法，得天然冰片微乳凝膠制備方法如下：稱取天然冰片0.3 g加入到0.5 g蓖麻油中、加入聚氧乙烯蓖麻油(EL)1.25 g和1，2-丙二醇0.25 g，于30 ℃水浴加熱至完全溶解，攪拌均勻得黃色澄清透明油狀混合物，將該油相混合物于30 ℃恒溫磁力攪拌下，將其緩緩滴入5 mL水中乳化，制得澄清透明、淡藍乳光的天然冰片微乳。稱取0.084 g卡波姆-940，加入甘油0.525 g潤濕，加水至10.8 g，攪拌均勻，靜置24 h使其充分溶脹作為凝膠基質。將天然冰片微乳緩慢加至已溶脹好的凝膠基質中，攪拌均勻，滴加體積分數為20%三乙醇胺溶液調pH值至5.43，于4000 r/min離心5 min除去氣泡，獲得澄清均勻細膩、黏稠度適中，且涂展性良好的天然冰片微乳凝膠。

2.6 微乳凝膠的質量評價

2.6.1 外觀性狀 所制成的微乳凝膠為外觀淡藍色澄清，均勻細膩、黏稠度適中，無油膩性，且涂展性良好的半固體。

2.6.2 微乳粒徑大小測定 取3份微乳液，用水稀釋5倍，用0.2 μm的微孔濾膜過濾，濾液采用粒徑測定儀測定其粒徑，粒徑分布圖與平均粒徑(均數±標準差)及多分散體系數平均值見表10與圖2。

由表9與圖2的結果表明，天然冰片微乳的平均粒徑為(45.28±7.95)nm，多分散系數為(0.258±0.126)，粒度分布均勻。

表9 微乳粒徑測定結果

圖2 微乳粒徑分布圖

2.6.3 pH值測定 取3批微乳凝膠中分別稱取1 g置于小燒杯中，并加入25 mL的水稀釋，用pH計分別測定其pH值。結果得出，微乳凝膠的pH 值分別為5.43、5.45、5.41，所得的pH值符合外用制劑關于pH的要求。

2.6.4 保濕率的測定 取3批天然冰片微乳凝膠適量，精密稱重記為(m1)，置于溫度為(25±2)℃、相對濕度(RH)為40%(飽和碳酸鉀溶液)的恒溫恒濕干燥器中。放置24 h后，取出樣品，精密稱重記為(m2)，根據公式：保濕率=m2/m1，計算樣品的保濕率。測得實驗結果，微乳凝膠的保濕率平均值為(93.55±0.29)%，表明其有良好的保濕性能，有利于在皮膚上涂布。

2.6.5 黏度的測定 取3批天然冰片微乳凝膠適量，采用Viscolead One黏度計測定微乳凝膠的黏度，結果天然冰片微乳凝膠的黏度分別為41889、41881、41879 mPa·s，RSD為0.01%(n=3)。

2.7 天然冰片微乳凝膠的定量測定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：SE-30毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；進樣口溫度：245 ℃；檢測器溫度：245 ℃；初始柱溫80 ℃，程序升溫，升溫速度：10 ℃/min，最終柱溫220 ℃，保溫3 min；載氣：氮氣；流速：0.5 mL/min；進樣量：2 μL。

2.7.2 專屬性考察 ①天然冰片對照品溶液：精密稱取天然冰片對照品15 mg，置于50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使其溶解并稀釋至刻度，搖勻即得；②供試品溶液：精密稱取天然冰片微乳凝膠2.0 g，乙酸乙酯溶解并定容至100 mL量瓶中，超聲混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取續濾液1.0 mL至10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋并定容至刻度，搖勻即得；③空白對照品溶液：精密稱取不含天然冰片微乳凝膠2.0 g，乙酸乙酯溶解并定容至100 mL量瓶中，超聲混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取續濾液1.0 mL至10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋并定容至刻度，搖勻即得。按照上述色譜條件測定。結果如圖3所示。天然冰片保留時間為9.3 min，供試品中天然冰片色譜峰與其他組分分離良好，且空白對照品無干擾。

圖3 天然冰片微乳凝膠含量測定GC色譜圖

2.7.3 標準曲線的繪制 精密量取1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL對照品溶液，分別置于10 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容至刻度，按上述色譜條件測定。以天然冰片對照品峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y=84965x+859.0，r=0.9994。結果天然冰片溶液在0.03～0.3 mg/mL線性關系良好。

2.7.4 精密度試驗 精密移取天然冰片對照品溶液 2 μL，重復進樣6次，測得天然冰片峰面積RSD為1.8%。

2.7.5 穩定性試驗 分別精密移取2μL供試品溶液于0、1、2、3、4、6 h后注入氣相色譜儀，測得天然冰片峰面積RSD為1.6%，表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

2.7.6 重復性試驗 按2.7.2項下②操作制備6份供試品溶液，依法測得天然冰片平均含量為19.92 mg/g，RSD為2.0%。

2.7.7 加樣回收試驗 精密稱取已知含量天然冰片微乳凝膠樣品(19.92 mg/g)9份，每份1g，分別精密加入0.0995 g/mL天然冰片對照液0.16、0.2、0.24 mL各3份，按“供試品溶液”制備項下方法制備9份溶液，依法測得峰面積，并計算含量。結果平均回收率為99.93%，RSD為1.49%(n=9)。見表10。

表10 回收率試驗結果

2.7.8 樣品測定 分別取3批天然冰片微乳凝膠各2.0 g，乙酸乙酯溶解并定容至100 mL量瓶中，超聲混勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取續濾液1.0～10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋并定容至刻度，搖勻即得。按照上述色譜條件測定。根據標準曲線計算天然冰片微乳凝膠中含天然冰片質量濃度。結果3批次天然冰片微乳凝膠中含天然冰片的質量濃度分別為19.56、20.34、20.15 mg/g。

2.8 穩定性實驗

2.8.1 高速離心試驗 取3批微乳凝膠適量，分別置于10 mL離心管中， 8000 r·min-1離心 15 min，結果3批天然冰片微乳凝膠離心后外觀淡藍色半透明，均勻細膩，未見分層，無油水分離等不穩定現象，涂布性能良好，表明天然冰片微乳凝膠高速離心后穩定。

2.8.2 耐寒試驗 取3批微乳凝膠適量，置于-5 ℃冰箱中放置24 h，取出后恢復至室溫，觀察樣品結果與試驗前樣品無明顯的差別。外觀仍舊是淡藍色半透明，未出現分層，變稀，泛粗、浮油，沉淀物等不穩定現象，均勻細膩，涂布性能良好；3批天然冰片微乳凝膠的pH值分別為5.43、5.45、5.41；黏度分別為41898、41902、41894 mPa·s；含天然冰片分別為21.09、20.35、20.83 mg/g。

2.8.3 耐熱試驗 取3批微乳凝膠適量，置于 40 ℃ 烘箱中放置12 h，取出恢復至室溫，結果外觀是淡藍乳白色半透明，未出現分層，但出現變稀，泛粗等不穩定現象，涂布性能較差；3批天然冰片微乳凝膠黏度分別為41912、41887、41893 mPa·s；含天然冰片分別為19.65、19.73、20.30 mg/g。表明制劑應低溫儲存。

3 討論

3.1 偽三元相圖的繪制 隨著Km的增大，即乳/助比例的增大，研究發現形成的微乳區域有明顯的先增大后減小的趨勢，其可能原因是乳化劑與助乳化劑在微乳液的形成過程中所發揮的作用不同，乳化劑在微乳的形成過程中，起著決定性作用，隨著其用量的增加，微乳越易形成且粒徑更加小，而助乳化劑是起著相當于穩定劑的作用，穩定所形成的微乳，其用量的減少會影響微乳的穩定性，不利于微乳的形成與儲存。所以在微乳制備過程中，必須確保乳化劑和助乳化劑保持適當的比例，只有這樣才能制備出優質穩定的微乳。

3.2 乳化溫度的選擇 在乳化溫度的確定過程中，發現乳化溫度影響微乳的外觀性狀，澄清度，透光率及粒徑的大小，天然冰片微乳凝膠的透光率隨溫度的升高而降低，這從側面反應微乳的粒徑隨溫度的升高而增大，微乳液的外觀由澄清透明有藍光變得藍白半透明。這是因為非離子型表面活性劑在充當乳化劑時，隨著微乳液溫度升高，分子熱運動變得越發劇烈，與氧原子結合的水分子發生脫落，分子間形成的氫鍵遭到破壞，乳化劑的親水性降低，溶解度下降，使原來澄明的溶液變渾濁，影響其對油相的乳化能力[8]，因此為了保證最大的乳化效果，選擇30 ℃作為乳化的穩定。

3.3 天然冰片微乳凝膠的制備 微乳凝膠常規的性狀是澄清透明或半透明，有淡藍光的，微乳與凝膠的加入方式對其有一定的影響，本實驗前期采用卡波姆直接加入到微乳中，結果所制成的天然冰片微乳凝膠都是乳白色的，不透明這可能是因為當卡波姆-940粉末溶于微乳的水相時，改變了微乳處方中的油/水比例，破壞天然冰片微乳結構，從而影響微乳的形成與穩定。后期改用微乳緩慢加入凝膠基質中，邊加邊攪拌，所得的微乳藍白色半透明，成型性好，粘稠度適中，符合外用制劑的相關要求。