柔肝方通過抑制纖維化蛋白抗肝纖維化的機制研究①

李茜 吳惠春 譚家鑫 黃凌鷹 高月求 李曼

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院上海市中醫臨床重點實驗室，細胞免疫學實驗室，上海 201203）

肝纖維化是各種病因引起的慢性肝病進展為肝硬化的必經環節，其關鍵過程是肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化并轉分化為肝成纖維細胞，大量合成細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分，引起ECM的進行性過度積累［1］。纖維化蛋白（fibrosin，FBRS）是一種由CD4+T細胞和成纖維細胞分泌的促進纖維化的細胞因子，能夠促進肌纖維母細胞的生成和膠原纖維的表達［2-4］。課題組前期研究發現，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者外周血CD4+T細胞表達的FBRS水平與肝纖維化程度正相關，提示FBRS參與了肝纖維化的發病過程［5］。柔肝方（Rougan Formula）是上海市名中醫王靈臺教授治療肝纖維化的有效驗方，以益氣養陰、活血化瘀為治則。前期臨床研究發現，柔肝方可顯著改善慢乙肝肝纖維化患者的癥狀、體征和肝功能，降低肝纖維化血清學指標，實驗研究證實RGF可抑制肝纖維化模型小鼠肝臟的膠原合成，但其機制尚不清楚［6-7］。因此，本研究在明確柔肝方主要成分基礎上，應用肝纖維化小鼠模型和體外細胞模型，深入研究柔肝方抗肝纖維化的分子機制，為闡釋中藥抗肝纖維化提供現代醫學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞6~8周齡健康BALB/c雄性小鼠74只，體質量18~21 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證為SCXK（浙）2019-0001，飼養于上海南方模式生物科技股份有限公司，動物倫理IACUC號為2020-0018，喂食標準顆粒飼料。雄性SD大鼠30只，體質量200~220 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，適應性飼養1周后使用。人肝星狀細胞株LX2細胞購自上海復蒙基因生物公司。

1.1.2 實驗藥物和主要試劑柔肝沖劑為曙光醫院的院內制劑（批號：Z05100975），購自上海曙光醫院藥房，組成如下：淫羊藿15 g、炙黃芪15 g、枸杞子12 g、炙鱉甲12 g、丹參30 g、郁金12 g、苦參12 g。對照品淫羊藿苷（貨號E-0062）、綠原酸（貨號E-0075）、黃芪甲苷（貨號E-0146）、芒柄花黃素（貨號E-0216）、丹參酮ⅡA（貨號E-0021）、丹酚酸B（貨號E-0136）、苦參堿（貨號E-0064）、氧化苦參堿（貨號E-0095），質量分數>98%，均購自上海同田生物技術有限公司；Ⅳ型刀豆蛋白A（ConA，C2010）購自美國Sigma公司；小鼠的ALT測試盒、AST測試盒、LN酶聯免疫檢測試劑盒、HA酶聯免疫檢測試劑盒、PⅢNP酶聯免疫檢測試劑盒、Col-Ⅳ酶聯免疫檢測試劑盒、HE染液購自南京建成生物技術研究所；Masson染液購自Solarbio公司；人重組FBRS蛋白購自Abnova；anti-α-SMA（ab124964）、anti-Col-Ⅰ（ab88147）和anti-TGF-β1（ab215715）購自英國Abcam公司；FBRS Polyclonal Antibody（PA5-60615）購自Thermo Fisher公司；GAPDH Antibody（60004-1-lg）購自Protein Tech公司；Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS酶聯免疫檢測試劑盒購自科諾迪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RGF化學成分及其入血成分的分析與鑒定應用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對RGF及其含藥血清的化學成分進行分析［8］，查閱《中華人民共和國藥典（2015年版）》分析柔肝方中各組成藥物的主要成分，使用淫羊藿苷、綠原酸、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、苦參堿、氧化苦參堿作為對照品進行成分分析。供試品的制備：分別取柔肝方于研缽中研磨，精密稱定柔肝方219.40 mg，加入甲醇溶液10 ml，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液100 μl，加到液相小瓶中，上樣分析。血漿樣品處理方法：取血漿10 ml，加入30 ml乙腈，渦旋1 min后，4 000 r/min離心10 min，精密移取37.50 ml上清，旋轉蒸發，加入500 L甲醇復溶，12 000 r/min離心10 min。精密吸取上清液100 L，轉移至液相小瓶，上樣分析。

1.2.2 動物分組及模型建立74只BALB/c小鼠按體質量隨機區組分為正常對照組、模型組和柔肝方低、中、高劑量組（RGF-L、RGF-M、RGF-H），其中對照組6只，其余每組各17只。按公式：小鼠給藥劑量（g/kg）=成人用藥量（g）/成人標準體重（kg）×9.1為中劑量組，低劑量組為中劑量組的1/2濃度，高劑量組為中劑量組的2倍濃度。除對照組外，造模小鼠按照12.5 mg/kg小鼠體質量予尾靜脈注射ConA試劑，1次/周，連續10周；對照組小鼠注射相應劑量生理鹽水［9］。柔肝方組在造模當日按照10 ml/kg小鼠體質量灌服中藥，其余組則灌服等量飲用水，1次/d，共10周。在第10次注射ConA后次日采集小鼠標本，取小鼠肝右葉約0.5 cm×0.5 cm大小的肝組織固定于4%多聚甲醛，48 h后經脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后用于后續染色。以天狼猩紅染色和Masson染色的膠原表達半定量結果作為判斷肝纖維化程度的指標。

1.2.3 各組小鼠肝臟指數及脾臟指數的測定稱量各組小鼠體質量，分離肝臟和脾臟后稱重，分別計算肝臟指數及脾臟指數：肝臟指數（%）=肝臟質量（g）/體質量（g）×100%；脾臟指數（%）=脾臟質量（g）/體質量（g）×100%［10-13］。

1.2.4 HE染色取肝組織石蠟切片，60℃烤片30 min后依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ染缸中脫蠟，每次10 min，梯度乙醇逐級脫水，100%、95%、85%、70%各3 min，自來水沖洗3次，洗凈乙醇，蘇木素染色5 min，水洗1次，伊紅染色30 s，用增色液沖洗2次，晾干封片鏡檢并采集圖像。

1.2.5 天狼猩紅染色取肝組織石蠟切片，常規脫蠟至水，用紙擦干肝組織周圍水滴，滴加1滴天狼猩紅染液于肝組織上，將載玻片放于濕盒中，置于37℃恒溫箱中25 min，無水乙醇分化1 min，二甲苯透明1 s，中性樹膠封片鏡檢并采集圖像，使用Image-pro plus軟件進行半定量分析陽性區域面積百分比。

沙美特羅替卡松聯合孟魯司特對比沙美特羅替卡松治療咳嗽變異性哮喘療效和安全性的Meta分析…… 馮文濤等（5）：699

1.2.6 Masson染色取肝組織石蠟切片，常規脫蠟至水，蘇木素染核，天青石藍染色液染10 min，充分水洗，麗春紅品紅染色液覆蓋住標本10 min，使用0.2%冰醋酸水溶液去除浮色，滴加磷鉬酸水溶液分化處理1 min，用苯胺藍染色液染5 min，冰醋酸水溶液清洗玻片，無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固鏡下觀察，使用Image-pro plus軟件進行半定量分析［14］。

1.2.7 肝功能指標和肝纖四項檢測取各組小鼠血清，應用生化法，根據ALT、AST、肝纖四項（HA、LN、PⅢNP、ColⅣ）說明書進行實驗測定其水平。

1.2.8 Western blot取30 mg肝組織放入含1%PMSF的細胞裂解液中，勻漿后冰上放置30 min，12 000 g離心15 min取上清，BCA法測定蛋白濃度并制樣。每次上樣量為30 μg，上樣體積為10 μl。使用12.5%分離膠分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜4次后加入二抗，TBST洗膜4次后顯影，并使用Image J軟件統計灰度值計算相對表達量［15］。

1.2.9 柔肝方含藥血清制備30只SD大鼠隨機分為正常對照組和柔肝方組（RGF組）。大鼠適應性喂養1周后，按1 ml/100 g灌胃體積予高劑量RGF灌胃，正常對照組灌服飲用水，每日早晚各灌胃1次，第3天灌胃后禁食、禁水12 h，第4天給藥1次后30 min腹主動脈取血［16］。室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，過濾滅活后-80℃凍存，備用。

1.2.10 重組FBRS蛋白刺激LX2細胞LX2細胞按照3×105個/孔接種于6孔板，培養12 h后，分為對照組和重組FBRS蛋白干預組，干預組分為不同時間和不同濃度，人重組FBRS蛋白（10 ng/ml）分別干預LX2細胞0 h、24 h和48 h，不同濃度FBRS蛋白（0、10、100 ng/ml）干預24 h。Western blot法檢測α-SMA表達。ELISA法測定培養上清Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達。

1.2.11 柔肝方含藥血清對LX2細胞活化的調節作用3×105個/孔的LX2細胞接種于6孔板，培養12 h，PBS洗2次，分為正常血清組、正常血清+FBRS刺激（100 ng/ml）組和柔肝方含藥血清+FBRS刺激組（100 ng/ml），10%血清培養48 h，Western blot法檢 測α-SMA水 平，Western blot和ELISA法 測 定Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達。

1.3 統計學處理本文實驗數據應用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 柔肝方化學成分及其入血成分分析結果應用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對柔肝方及其含藥血清的化學成分進行分析，結果顯示，根據標準品鑒定每克柔肝方中主要成分含量如下：綠原酸195.79 ng，黃芪甲苷88.52 ng，芒柄花黃素13.72 ng，淫羊藿苷1 186.46 ng，丹參酮ⅡA 6.93 ng，丹酚酸B 75 236.24 ng，苦參堿1.66 ng，氧化苦參堿24.91 ng。

柔肝方入血成分分析結果顯示，主要為淫羊藿苷、綠原酸、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、苦參堿和氧化苦參堿，詳見表1。

表1 柔肝方入血成分鑒定情況Tab.1 Identification of serum components of Rougan Formula

2.2 柔肝方降低ConA肝纖維化模型小鼠的肝臟指數和脾臟指數尾靜脈注射ConA建立肝纖維化小鼠模型，并予柔肝方不同劑量進行治療。與對照組相比，模型組小鼠肝臟指數與脾臟指數明顯增高（P<0.01，P<0.001）；與模型組相比，柔肝方組肝臟指數和脾臟指數均有下降趨勢，其中高劑量組降低最為顯著（P<0.001，圖1）。

圖1 柔肝方對ConA肝纖維化模型小鼠肝臟指數和脾臟指數的影響Fig.1 Effects of Rougan Formula on liver index and spleen index of ConA-induced hepatic fibrosis model mice

2.3 柔肝方改善ConA肝纖維化模型小鼠肝組織炎癥、減少膠原沉積如圖2所示，HE染色結果表明，對照組小鼠肝小葉結構清晰、完整，肝索呈放射狀排列，排列規則，無變形、壞死；模型組小鼠肝小葉結構被破壞，肝索排列紊亂，可見多處肝組織壞死區域，并有大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，柔肝方各用藥組小鼠肝小葉結構破壞程度明顯減輕，炎癥浸潤細胞明顯減少。天狼猩紅染色和Masson染色結果表明，對照組未見膠原沉積；模型組小鼠肝小葉結構被破壞，膠原沉積明顯增多，形成了纖維間隔，甚至假小葉形成；與模型組相比，柔肝方用藥組膠原沉積呈劑量依賴性減少。

圖2 柔肝方對小鼠肝組織炎癥和膠原沉積的改善作用Fig.2 Effects of Rougan Formula on inflammation and collagen deposition in mice liver tissue

2.4 柔肝方改善ConA模型小鼠的肝功能和降低血清肝纖維化指標表達的作用與對照組相比，ConA模型組小鼠血清ALT、AST、肝纖四項（HA、LN、PⅢNP、Col-Ⅳ）水平顯著升高（P<0.001）；與模型組相比，柔肝方組ALT、AST、肝纖四項水平較模型組有明顯降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 柔肝方對小鼠肝功能和纖維化指標的改善作用Fig.3 Effects of Rougan Formula on liver function and fibrosis related items in mice

2.5 柔肝方降低ConA肝纖維化模型小鼠肝組織FBRS的表達為探究柔肝方抑制ConA肝纖維化模型小鼠肝臟膠原沉積的分子機制，檢測了柔肝方對肝內肝星狀細胞活化相關指標的調節作用。結果表明，柔肝方可明顯降低模型小鼠肝組織的α-SMA、Col-Ⅰ、TGF-β1、FBRS的表達水平（P<0.01，P<0.001），提示柔肝方可能通過抑制肝星狀細胞的活化、減少膠原沉積發揮抗肝纖維化的作用。見圖4。

圖4 柔肝方對肝組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ、FBRS蛋白表達的調節作用Fig.4 Effects of Rougan Formula regulating protein expressions of TGF-β1，α-SMA，Col-Ⅰand FBRS

2.6 重組FBRS蛋白可誘導LX2細胞活化為明確柔肝方抑制肝星狀細胞活化的機制，體外應用重組FBRS蛋白刺激人肝星狀細胞系LX2。結果表明，隨著重組FBRS蛋白濃度和作用時間的增加，LX2細胞表達α-SMA水平逐漸增加，提示FBRS可以活化肝星狀細胞。此外，重組FBRS蛋白可上調LX2胞內和分泌的Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達水平（P<0.05），其中胞內蛋白應用Western blot法測定，分泌蛋白應用ELISA法測定。見圖5。

圖5 重組FBRS蛋白對LX2細胞活化的調節作用Fig.5 Effects of recombinant FBRS proteins activating in LX2 cells

2.7 柔肝方含藥血清可抑制FBRS誘導的LX2細胞的活化應用柔肝方藥物血清干預經FBRS刺激的LX2細胞，結果表明柔肝方含藥血清不僅抑制FBRS誘導的LX2表達α-SMA，且抑制LX2的胞內和分泌的Col-Ⅰ、TGF-β1、FBRS水平（P<0.05，圖6），提示柔肝方通過抑制FBRS誘導肝星狀細胞活化，抑制膠原分泌，發揮抗纖維化作用。

圖6 柔肝方抑制LX2細胞激活和膠原沉積Fig.6 RGF inhibits activation and collagen deposition of LX2 cells

3 討論

肝纖維化是慢性或反復肝損傷的最終共同途徑，急性的、自限性纖維化是一種對組織損傷可逆的保護性反應，終末期肝纖維化導致肝硬化，伴有危及生命的后果，但目前除病因治療或肝移植，仍沒有公認的治療肝纖維化的有效方法［17-18］。中醫藥在肝纖維化的治療上有明確優勢，明確其抗肝纖維化的機制將有助于發現新的肝纖維化治療靶點及有效藥物［19］。

3.1 柔肝方是治療肝纖維化的有效驗方柔肝方是曙光醫院肝病科治療肝纖維化的有效驗方，前期臨床研究證實柔肝方聯合恩替卡韋治療乙肝后肝纖維化患者，其肝功能指標、肝臟彈性值的改善作用明顯優于恩替卡韋對照治療組［20］。柔肝方對CHB患者具有一定的抑制病毒復制的作用，病理結果顯示有一定的抗炎、抗纖維化作用，其療效與抑制HSC的激活有關［6-7］。

3.2 FBRS在肝纖維化發病機制中的作用TGF-β1是目前已知的致肝纖維化最重要的細胞因子，可來源于自分泌和旁分泌。發生肝纖維化時，TGF-β1生成顯著增多，刺激HSC轉化為MFB，產生大量ECM，導致肝纖維化［21-22］。1993年，FBRS作為一種新的促纖維化的細胞因子被發現，其在血吸蟲性肝纖維化和酒精性肝纖維化時均有高表達［2，23-24］。研究表明，FBRS會促進表達α-SMA的肌纖維母細胞的生成，同時促進膠原纖維的表達［4］。宗欣等［25］研究表明，隨著肝纖維化的程度不同，血清FBRS mRNA表達水平隨肝臟膠原沉積水平同步升高。另外，肝組織FBRS mRNA表達水平與肝纖四項檢查均呈正相關。前期研究中，發現CHB患者肝纖維化的程度越高，其外周血CD4+T細胞的FBRS表達水平越高，表明CD4+T細胞的FBRS表達與肝纖維化程度密切相關，但相關的機制尚未探討［5］。

3.3 柔肝方通過調節FBRS表達抗肝纖維化的機制本研究中，應用ConA肝纖維化模型小鼠證實，柔肝方可減少組織中炎癥細胞浸潤，減輕炎癥反應，降低血清ALT、AST水平，減少小鼠肝內膠原沉積，與前期CCL4肝纖維化模型的研究結果一致［26］。α-SMA是HSC活化的標志物，RGF可下調肝纖維化模型小鼠肝組織α-SMA、Col-Ⅰ、TGF-β1和FBRS表達，提示柔肝方可抑制HSC的活化，其機制可能與調節FBRS表達有關。

體外研究證實，重組FBRS蛋白可誘導人肝星狀細胞LX2細胞表達α-SMA，提示FBRS可作為誘導LX2活化的始動因素之一。進一步應用柔肝方藥物血清干預，證實柔肝方可降低FBRS上調的α-SMA、Col-Ⅰ和TGF-β1表達，提示柔肝方對FBRS誘導的LX2細胞活化具有抑制作用。FBRS可上調TGF-β1的表達，但在TGF-β1在FBRS誘導LX2細胞活化中的作用仍有待研究。

3.4 柔肝方抗肝纖維化可能的效應物質鑒定柔肝方的主要入血成分是淫羊藿苷、綠原酸、丹酚酸B、黃芪甲苷、芒柄花黃素、丹參酮ⅡA、苦參堿、氧化苦參堿，其可能是抗纖維化作用的主要物質。有研究表明，淫羊藿苷能抑制HSC的上皮-間充質轉化和膠原蛋白的降解，對CCL4誘導的肝纖維化小鼠模型具有保肝作用［27］。丹酚酸B通過調節TGF-β/Smad和MAPK信號通路減輕肝纖維化，特別是抑制MAPK介導的P-Smad2/3L信號通路［28］。綠原酸能夠劑量依賴性的改善CCL4導致的肝纖維化大鼠的肝功能和氧化應激，抑制膠原纖維的增生起到保肝和抗肝纖維化作用［29］。在今后的實驗中，將針對柔肝方主要入血成分的抗肝纖維化作用進行篩選和鑒定，以期進一步明確柔肝方抗肝纖維化的效應物質。

綜上，本研究在明確FBRS誘導HSC活化的基礎上，初步探討中藥柔肝方通過調節FBRS抗肝纖維化的機制。將在后續研究中，應用已建立的FBRS誘導HSC活化的篩選體系對柔肝方的各主要活性成分進行抗肝纖維化作用的篩選，為明確中藥柔肝方肝纖維化的機制提供現代醫學依據，為開發有效的機制明確的現代中藥奠定基礎。