miR-543靶向HDAC3調控LPS誘導的氣道上皮細胞損傷

孫智娜 何秀琴 拉毛卓瑪

（青海紅十字醫院呼吸與危重癥醫學科，西寧 810000）

支氣管哮喘是由多種炎癥細胞、細胞組分參與形成的氣道炎癥性疾病。支氣管上皮細胞作為重要的氣道結構細胞，是維持呼吸道防御屏障的關鍵，當吸入刺激性異物時，支氣管上皮細胞的結構受損，其自然保護功能受到破壞，引起感染和氣道炎癥，參與哮喘的發生、發展［1］。因此，如何有效的減輕氣道上皮損傷對哮喘防治意義重大。miR-543是近年發現的人類疾病相關RNA，脊髓損傷大鼠模型中miR-543表達降低，過表達miR-543可降低脊髓損傷大鼠的炎癥反應，抑制細胞凋亡［2］。過表達miR-543還可有效對抗IL-1β誘發的軟骨細胞損傷［3］。生物信息學分析發現，組蛋白脫乙酰酶3（histone deacetylases 3，HDAC3）是miR-543的潛在靶點。既往研究顯示，HDAC3在缺血性腦損傷小鼠的小膠質細胞中表達增加，抑制其表達可減輕缺血性腦損傷導致的炎癥反應［4］。抑制HDAC3表達對糖尿病小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用［5］。然而，miR-543和HDAC3在支氣管哮喘疾病中對支氣管細胞損傷的研究較少。本研究以脂多糖（lipopolysaccha?ride，LPS）誘導人氣道上皮細胞BEAS-2B損傷，探討miR-543靶向HDAC3對BEAS-2B細胞凋亡、炎癥損傷的影響，以期為支氣管哮喘防治提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人氣道上皮細胞株BEAS-2B購于中國科學院典型培養物保藏中心；RPMI1640培養液、胎牛血清購于美國Hyclone公司；LPS購于美國Sigma公司；miR-543模擬物（miR-543 mimics）及其陰性對照（miR-NC）、HDAC3小干擾RNA（si-HDAC3）及其陰性對照（si-NC）、miR-543抑制物（anti-miR-543）及其陰性 對 照（anti-miR-NC）、HDAC3過表達 質粒（pcDNA-HDAC3）、空載體質粒（pcDNA）、PCR引物由上海生工公司提供；Hairpin-it TM miRNA qPCR試劑盒購于上海吉瑪制藥技術有限公司；SYBR Green master mix購于北京索萊寶生物技術公司；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒、鼠源HDAC3抗體、兔源B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體、兔源Bcl相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phos?phate dehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組BEAS-2B細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37℃、5%CO2的培養箱中培養。對照組（Con）：用完全培養基培養細胞；LPS組：參照文獻［6］用LPS終濃度為50μg/ml的RPMI1640培養基處理BEAS-2B細胞8 h；LPS+miR-NC組、LPS+miR-543組、LPS+si-NC組、LPS+si-HDAC3組、LPS+miR-543+pcDNA組、LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3組為利用脂質體轉染法將miR-NC、miR-543 mimics、si-NC、si-HDAC3、miR-543 mimics+pcDNA、miR-543 mimics+pcDNA-HDAC3分別轉染至BEAS-2B細胞，隨后用終濃度為50 μg/ml的RPMI1640培養基處理BEAS-2B細胞8 h。

1.2.2 RT-qPCR檢 測miR-543和HDAC3 mRNA表達利用TRIzol試劑從各組BEAS-2B細胞中分離得到總RNA。用DU650分光光度計測定分離RNA的純度和濃度。以U6為內參，用Hairpin-it TM miRNA qPCR試劑盒檢測miR-543表達。以GAPDH為內參，SYBR Green qPCR法檢測HDAC3 mRNA表達。2-ΔΔCt法進行數據處理。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測細胞培養液上清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平BEAS-2B細胞按照實驗分組處理后，收集培養基上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定IL-6、IL-1β和TNF-α濃度。酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組BEAS-2B細胞，調整為1×106個/ml的細胞懸液。取100 μl細胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書檢測BEAS-2B細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測HDAC3、Bcl-2和Bax蛋白表達收集各組BEAS-2B細胞，細胞裂解液提取總蛋白。4℃、13 000 g離心20 min，BCA蛋白檢測試劑盒測定上清中的蛋白濃度。取25μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后將其轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h。加入一抗溶液4℃孵育過夜。用二抗溶液室溫孵育膜1 h。洗膜后，用Syngene軟件對印跡進行分析。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗將含有miR-543結合位點的野生型（WT）或含有miR-543結合位點突變序列的突變型（MUT）的3'UTR-HDAC3分別插入pmirGLO熒光素酶報告載體，分別命名為WTHDAC3、MUT-HDAC3，該步驟由北京華大基因有限公司完成。利用Lipofectamine 2000試劑將WT/MUTHDAC3分 別 與miR-543 mimics或miR-NC轉 染 到BEAS-2B細胞，轉染48 h使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測BEAS-2B細胞熒光素酶活性。

1.3 統計學分析每個實驗組設置3個平行實驗，重復3次。實驗數據以±s表示。采用SPSS20.0軟件進行統計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，通過SNK-q法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-543和HDAC3在LPS誘導的氣道上皮細胞損傷中的表達與Con組比較，LPS組BEAS-2B細胞中miR-543表達顯著降低，而HDAC3 mRNA和HDAC3蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見圖1、表1。

表1 miR-543和HDAC3在LPS誘導的氣道上皮細胞損傷中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-543 and HDAC3 in LPS-in?duced airway epithelial cell injury（±s，n=9）

表1 miR-543和HDAC3在LPS誘導的氣道上皮細胞損傷中的表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-543 and HDAC3 in LPS-in?duced airway epithelial cell injury（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05.

Groups Con LPS t P miR-543 1.00±0.07 0.55±0.051）16.693<0.01 HDAC3 mRNA 1.00±0.06 2.85±0.271）20.066<0.01 HDAC3 protein 0.39±0.03 0.78±0.061）17.441<0.01

圖1 HDAC3蛋白表達Fig.1 HDAC3 protein expressions

2.2 miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞炎癥因子表達的影響與Con組比較，LPS組BEAS-2B細胞中miR-543表達顯著降低，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表達顯著升高，細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低；與LPS+miR-NC組 比 較，LPS+miR-543組BEAS-2B細 胞 中miR-543表達顯著升高，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表達顯著降低，細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見表2、圖2。

表2 miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表2 miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS+miR-NC group，2）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-543 F P miR-543 1.00±0.05 0.53±0.051）0.51±0.04 0.86±0.072）185.843<0.01 IL-6/（ng·ml-1）56.32±5.88 136.25±11.251）139.58±10.52 69.33±6.252）221.135<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）21.58±2.34 58.23±5.221）61.39±6.14 36.22±3.272）157.934<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）95.36±9.28 183.62±13.471）188.25±14.62 125.32±10.272）126.265<0.01 Apoptosis rate/%6.32±0.63 27.14±2.771）29.82±2.84 11.36±1.172）275.604<0.01 Bcl-2 protein 0.69±0.06 0.27±0.031）0.25±0.03 0.58±0.052）223.101<0.01 Bax protein 0.32±0.03 0.76±0.071）0.78±0.08 0.40±0.042）149.130<0.01

圖2 miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-543 overexpression on LPS-induced apoptosis of airway epithelial cells

2.3 miR-543靶向調控HDAC3的表達TargetScan在線分析顯示，miR-543與HDAC3的3'UTR之間存在互補結合位點，見圖3。miR-543 mimics與WTHDAC3共轉染組BEAS-2B細胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-HDAC3共轉染組顯著降低（P<0.05）；而miR-543 mimics與WT-HDAC3共轉染組BEAS-2B細胞熒光素酶活性與miR-NC和WT-HDAC3共轉染組比較差異無統計學意義，見表3。miR-543組BEAS-2B細胞HDAC3蛋白表達較miR-NC組顯著降低；anti-miR-543組BEAS-2B細胞HDAC3蛋白表達較miR-NC組顯著升高（P<0.05），見圖4、表4。

表4 miR-543調控HDAC3蛋白的表達（±s，n=9）Tab.4 miR-543 regulates expression of HDAC3 protein（±s，n=9）

表4 miR-543調控HDAC3蛋白的表達（±s，n=9）Tab.4 miR-543 regulates expression of HDAC3 protein（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-543 anti-miR-NC anti-miR-543 F P 0.43±0.04 0.21±0.021）0.40±0.03 0.86±0.072）347.846<0.01 HDAC3

圖4 HDAC3蛋白表達Fig.4 HDAC3 protein expression

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.3 Dual luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-543 t P WT-HDAC3 0.99±0.07 0.36±0.041）23.443<0.01 MUT-HDAC3 1.00±0.06 0.98±0.06 0.707 0.490

圖3 HDAC3的3'UTR中含有與miR-543互補的核苷酸序列Fig.3 3'UTR of HDAC3 contains a nucleotide sequence complementary to miR-543

2.4 干擾HDAC3表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的影響與Con組比較，LPS組BEAS-2B細胞HDAC3和Bax蛋白表達、凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表達顯著升高；與LPS+si-NC組比較，LPS+si-HDAC3組BEAS-2B細胞HDAC3和Bax蛋白表達、凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α表達顯著降低（P<0.05）。見圖5、表5。

表5 干擾HDAC3表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的影響（±s，n=9）Tab.5 Effects of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表5 干擾HDAC3表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的影響（±s，n=9）Tab.5 Effects of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P<0.05；compared with LPS+si-NC group，2）P<0.05.

Groups Con LPS LPS+si-NC LPS+si-HDAC3 F P HDAC3 protein 0.37±0.04 0.81±0.071）0.82±0.08 0.48±0.042）130.924<0.01 IL-6/（ng·ml-1）51.78±5.22 138.62±12.361）142.96±13.25 78.55±7.862）175.011<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）22.65±2.27 63.59±6.281）64.87±6.33 40.57±4.852）135.931<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）91.23±9.36 186.32±14.571）191.36±15.32 141.52±13.572）108.997<0.01 Apoptosis rate/%7.21±0.72 26.58±2.631）28.47±2.88 14.63±1.422）206.270<0.01 Bcl-2 protein 0.67±0.06 0.26±0.031）0.25±0.03 0.51±0.052）189.987<0.01 Bax protein 0.31±0.03 0.77±0.071）0.79±0.08 0.44±0.042）150.152<0.01

圖5 干擾HDAC3表達對LPS誘導的氣道上皮細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of interfering with HDAC3 expression on LPS-induced apoptosis of airway epithelial cells

2.5 HDAC3過表達逆轉了miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的作用與LPS+miR-NC組 比 較，LPS+miR-543組BEAS-2B細 胞HDAC3和Bax蛋白表達、凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α顯著降低；與LPS+miR-543+pcDNA組比較，LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3組BEAS-2B細胞HDAC3和Bax蛋白表達、凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，培養液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α顯著升高（P<0.05）。見表6、圖6。

表6 HDAC3過表達逆轉了miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的作用（±s，n=9）Tab.6 HDAC3 overexpression reverses effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

表6 HDAC3過表達逆轉了miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的作用（±s，n=9）Tab.6 HDAC3 overexpression reverses effect of miR-543 overexpression on LPS-induced airway epithelial cell damage（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+miR-NC group，1）P<0.05；compared with LPS+miR-543+pcDNA group，2）P<0.05.

Groups LPS+miR-NC LPS+miR-543 LPS+miR-543+pcDNA LPS+miR-543+pcDNA-HDAC3 F P HDAC3 protein 0.83±0.07 0.42±0.041）0.40±0.03 0.72±0.072）136.073<0.01 IL-6/（ng·ml-1）141.36±13.25 68.23±6.821）66.98±6.63 120.54±12.012）123.726<0.01 IL-1β/（ng·ml-1）62.58±6.28 38.22±3.811）35.49±3.55 50.43±5.012）60.704<0.01 TNF-α/（ng·ml-1）189.25±13.54 117.36±11.471）115.93±12.53 168.37±13.422）75.158<0.01 Apoptosis rate/%27.22±2.73 12.24±1.251）11.73±1.18 21.58±2.162）135.471<0.01 Bcl-2 protein 0.24±0.03 0.57±0.051）0.59±0.06 0.36±0.032）130.329<0.01 Bax protein 0.76±0.07 0.39±0.041）0.37±0.03 0.65±0.062）122.045<0.01

3 討論

微小RNA（microRNAs，miRNA）是由18~25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，其通過在轉錄后水平調控基因表達在包括哮喘在內的多種肺部疾病中發揮作用［6］。研究顯示，哮喘患者中miR-192-5p表達下調，上調miR-192-5p可抑制Ⅰ型膠原蛋白沉積，減輕哮喘患者的氣道重塑和氣道平滑肌細胞自噬［7］。miR-20b可能通過調控血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達對哮喘小鼠氣道炎癥產生抑制作用［8］。上調miR-20a-5p通過調控信號轉導和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達可降低細胞的生存能力，促進TGF-β1引發的細胞凋亡，是哮喘治療的潛在靶點［9］。LPS是一種內毒素，可誘導免疫細胞、非免疫細胞的炎癥反應，誘導氣道上皮細胞損傷［10-12］。本研究發現，LPS誘導后BEAS-2B細胞凋亡率、凋亡促進蛋白Bax表達、炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌顯著升高，miR-543表達降低，提示miR-543可能參與氣道上皮細胞損傷。進一步功能獲得實驗驗證miR-543功能發現，恢復miR-543表達可降低LPS誘導下炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，降低Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白，抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡。提示過表達miR-543可減輕LPS誘導的氣道上皮細胞凋亡和炎癥損傷。

HDAC3是HDAC家族成員之一，研究顯示HDAC可能通過影響絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路，控制炎癥細胞因子水平，最終引起哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤，增加氣道炎癥反應，使用HDAC抑制劑可緩解哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應［13-14］。然而，有研究指出，哮喘患者、香煙煙霧刺激的致敏大鼠氣道HDAC2活性降低，與疾病的嚴重程度呈正相關［15-16］。本研究發現LPS誘導后BEAS-2B細胞中HDAC3表達顯著升高，進一步功能缺失實驗探索HDAC3功能作用發現，干擾HDAC3表達可降低LPS誘導下炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，降低Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白，抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡，與過表達miR-543作用相一致。同時，本研究發現HDAC3是miR-543的 下 游 靶 基 因，且miR-543對HDAC3具有負調控作用。過表達HDAC3能夠逆轉miR-543過表達對LPS誘導的氣道上皮細胞凋亡和炎癥損傷的影響。提示miR-543對LPS誘導的氣道上皮細胞損傷的保護作用與調控HDAC3表達有關。

綜上所述，miR-543通過靶向下調HDAC3可抑制LPS誘導的氣道上皮細胞的凋亡和炎癥損傷。因此，miR-543有望成為支氣管哮喘防治的有效靶點。