成人哮喘患者Treg/Th17細胞失衡與呼出氣一氧化氮的相關性研究①

覃松梅 劉彤 龍勝澤 藍嬌 韋彩周 農向陽 冉果 覃雪軍

（廣西壯族自治區人民醫院呼吸與危重癥醫學科，南寧 530021）

支氣管哮喘是由肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等多種細胞和細胞組分參與的一種以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，其發病率在逐年上升，成為最常見的慢性疾病之一［1］。據統計，全球約有4.3%人口罹患哮喘，我國最新流行病學調查資料顯示哮喘的總患病率為4.2%，即我國可能有4 570萬哮喘患者。哮喘的發病機制目前尚不明確，可能與感染、環境因素、過敏體質和多基因遺傳等相關［2］。近年來，哮喘患者體內Treg與Th17細胞失衡逐漸被認識并日益受到關注。控制氣道炎癥和緩解哮喘癥狀是治療哮喘的最終目標。FeNO是由氣道細胞產生，可作為一種非創傷性并可直接量化氣道炎癥的生物標志物，已成為氣道炎癥研究的新熱點。故本研究檢測了哮喘與慢性咳嗽非哮喘患者FeNO值及外周血Treg/Th17細胞，旨在分析哮喘患者FeNO水平與Treg/Th17失衡的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料回顧分析廣西壯族自治區人民醫院自2017年12月至2018年6月呼吸與危重癥醫學科收治的慢性咳嗽患者33例，其中17例為哮喘慢性持續期及咳嗽變異性哮喘患者，16例為非哮喘及非咳嗽變異性哮喘的慢性咳嗽患者。哮喘診斷、分級分期及咳嗽變異性哮喘診斷標準參照2016年版《支氣管哮喘防治指南》［3］。（1）典型哮喘的臨床癥狀和體征：①反復發作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間及晨間多發，常與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激以及上呼吸道感染、運動等有關；②發作時雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長；③上述癥狀和體征可經治療緩解或自行緩解。（2）可變氣流受限的客觀檢查：①支氣管舒張試驗陽性（吸入支氣管舒張劑后，FEV1增加>12%，且FEV1絕對值增加>200 ml）；②支氣管激發試驗陽性；③呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）平均每日晝夜變異率>10%，或PEF周變異率>20%。符合典型哮喘的臨床癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的任一條，并排除其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽，可以診斷為哮喘。哮喘慢性持續期是指每周均不同頻度和（或）不同程度地出現喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。非哮喘的慢性咳嗽按2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》［4］診斷標準排除表現為慢性咳嗽的支氣管哮喘及咳嗽變異性哮喘患者。咳嗽變異性哮喘：咳嗽作為唯一或主要癥狀，無喘息、氣急等典型哮喘的癥狀和體征，同時具備可變氣流受限客觀檢查中的任一條，排除其他疾病所引起的咳嗽。慢性咳嗽診斷標準參照2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》［4］：咳嗽持續時間超過8周，肺部影像學未見異常。納入標準：①所有研究對象年齡≥15周歲；②無精神障礙；③無肺炎。排除標準：①來院時處于哮喘急性發作期及緩解期的患者，由于哮喘急性發作會誘發許多相關免疫反應，而緩解期患者免疫狀態相對穩定，故予排除；②合并嚴重心、肝、腎等臟器疾病；③近期（1個月內）采用過全身激素治療；④妊娠或哺乳期。本研究得到了廣西壯族自治區人民醫院倫理委員會的批準。

1.1.2 儀器及試劑流式細胞儀（BD FACS CantoⅡ，美國）；流式抗體、淋巴細胞刺激劑（BD公司，美國）；標準胎牛血清（CellMax，新西蘭）；RPMI1640培養基（Gibco，美國）；Foxp3/轉錄因子染色緩沖液（Thermo，美國）；IL-17 ELISA試劑盒（Abcam公司，英國）；酶標儀（山東高密彩虹分析GF-M3000，中國）；納庫侖呼氣分析儀（Sunvou，中國）；MasterScreen肺功能儀（耶格公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 肺功能測定用力肺活量（FVC）和第1秒用力呼氣容積（FEV1）：由同一位經肺功能檢測培訓的醫師完成。

1.2.2 呼出氣一氧化氮測定FeNO值測定由同一位接受過培訓的技師通過納庫侖呼氣分析儀完成。檢測前1 d禁熏制品及腌制品等食物，檢測前1 h禁止進食、吸煙、劇烈運動等。使用鼻夾夾緊患者鼻部，讓患者吸氣到最大肺活量通過濾嘴緩慢向測試儀器呼氣，保持呼氣速率（50±5）ml/s，儀器自動分析得出FeNO值。

1.2.3 外周血Treg和Th17細胞的檢測真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml，分別在2個流式檢測管內取500 μl全血，加入2 ml紅細胞裂解液，充分攪拌均勻后裂解5~10 min，融入1640培養基至8 ml，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加入適量1640重懸，加入細胞刺激劑置于5%CO2培養箱37℃孵育6 h。第一管加入熒光標記單抗CD4-FITC 20μl，第二管加入抗體CD4-FITC、CD25-APC各20 μl，常溫避光孵育25 min。兩管分別先后加入細胞固定/破膜緩沖液1.5 ml、染色緩沖液1 ml，常溫避光孵育20~30 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清。于第一管內加入胞內熒光標記單抗IL-17A-PerCP-Cy5.5 5 μl，第二管加入抗體FoxP3-PE 20 μl，常溫避光孵育30 min。加入1 ml染色緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入2%多聚甲醛200μl重懸細胞并固定，采用流式細胞儀檢測。

1.2.4 ELISA檢測外周血血漿IL-17水平真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml，4℃、2 000 r/min離心5 min，收集上清-80℃保存，IL-17水平檢測嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。每份標本測定2次，結果取平均值。

1.3 統計學方法組間數據采用SPSS22.0軟件進行處理，變量呈正態分布，采用t檢驗和非參數檢驗。指標間的相關性采用Pearson分析或Spearman秩相關分析，數據用±s表示。P<0.05為組間差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基礎資料對比共納入患者33例，哮喘組17例，其中咳嗽變異性哮喘7例、輕度慢性持續期哮喘4例、中度慢性持續期哮喘6例；非哮喘慢性咳嗽組16例，其中變應性咳嗽10例、胃食管反流性咳嗽6例。各組年齡、性別差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

表1 各組基礎資料對比Tab.1 Comparison of basic data of each group

2.2 Treg、Th17細胞、Treg/Th17、IL-17、FeNO表達情況兩組外周血Treg占CD4+T淋巴細胞比例無明顯差異［（0.80±0.39）%vs（1.04±0.25）%，P=0.091］；哮喘組患者外周血Th17細胞占CD4+T淋巴細胞比例明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組［（4.01±2.11）%vs（0.93±0.75）%，P<0.001］；哮喘組Treg/Th17細胞的比值明顯低于非哮喘的慢性咳嗽組［（0.24±0.19）% vs（2.55±2.59）%，P<0.001］；哮喘組外周血血漿IL-17濃度明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組［（4.60±1.96）ng/L vs（3.01±1.97）ng/L，P=0.012］；哮喘組FeNO水平高于非哮喘的慢性咳嗽組［（95.53±37.86）ppb vs（26.94±9.84）ppb，P<0.001］。見表2和圖1、2。

圖1 外周血Treg、Th17細胞流式圖Fig.1 Flow cytometry of Treg，Th17 cells in peripheral blood

表2 兩組外周血Treg、Th17細胞占CD4+T淋巴細胞比例比較（±s）Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups（±s）

表2 兩組外周血Treg、Th17細胞占CD4+T淋巴細胞比例比較（±s）Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups（±s）

Groups Asthma group Chronic cough group t Z P Number of cases（n）17 16 Treg/%0.80±0.39 1.04±0.25-1.766-0.091 Th17/%4.01±2.11 0.93±0.75--3.942<0.001 Treg/Th17 0.24±0.19 2.55±2.59--3.809<0.001

2.3 Treg、Th17、Treg/Th17和FeNO之 間 的 相 關性哮喘組FeNO值與外周血Treg占比無相關性（r=-0.328，P=0.253），與Th17細胞占CD4+T淋巴細胞比例呈正相關（r=0.663，P=0.01），與Treg/Th17細胞比值呈負相關（r=-0.757，P=0.002），見圖3。

圖2 兩組外周血Treg、Th17細胞、Treg/Th17、血漿IL-17濃度、FeNO水平對比Fig.2 Comparisons of Treg，Th17 cells，Treg/Th17 in peripheral blood，IL-17 concentration in plasma and level of FeNO between two groups

圖3 FeNO水 平 與Treg、Th17細 胞、Treg/Th17細 胞 的相關性Fig.3 Correlations between FeNO and Treg，Th17 cells，Treg/Th17

3 討論

哮喘是呼吸科常見的氣道慢性炎癥疾病。近年來隨生活習慣及環境的改變，其發病率呈逐年上升的趨勢。數據顯示全世界哮喘患者大約有1.5~2億例，而治療哮喘的過程漫長，給家庭和社會帶來較重的經濟負擔［5］。研究表明哮喘患者氣道的慢性炎癥主要是由輔助性T（Th）淋巴細胞介導所致，其中Th1/Th2細胞及其特征細胞因子譜的失衡被認為與哮喘的發病密切相關，Th1/Th2失衡參與疾病的發病過程，但逆轉Th1/Th2失衡卻不能使哮喘患者的癥狀得到完全緩解［6-8］。有學者發現在哮喘患者體內還存在Treg細胞與Th17細胞失衡［9］。

Th17細胞是一種能夠分泌IL-17的T細胞亞群，在自身免疫病、感染等疾病中發揮重要作用［10］。Th17細胞的分化由RORγt和RORα共同介導，IL-23并不參與初始T淋巴細胞的分化，但其也是維持Th17細胞增殖和功能穩定的重要因子。Treg是免疫反應的負性調節細胞，在多種疾病中參與調節變態反應、自身免疫反應和移植物抗宿主反應等，避免機體出現免疫失衡［11-12］。JIANG等［13］研究表明，在被卵清蛋白致敏的小鼠哮喘模型中，小鼠肺組織里Treg/Th17細胞比例降低，表明小鼠哮喘的發病與Treg/Th17細胞失衡存在一定聯系。本研究分析哮喘患者與非哮喘慢性咳嗽患者Treg、Th17細胞及其細胞因子IL-17表達水平的差異，發現與非哮喘慢性咳嗽組相比，哮喘組Th17細胞呈高表達，且IL-17的表達也呈高表達，進一步說明，Th17細胞及IL-17的表達水平上升與哮喘發病密切相關。其原因是哮喘患者在接觸過敏原刺激后，Th17細胞生成IL-17，促進氣道嗜酸粒細胞浸潤性炎癥反應，最終促使患者哮喘發作［14］。

T淋巴細胞在哮喘發生過程中具有重要調節作用，T細胞參與氣道炎癥的免疫反應，調節免疫應答。在正常情況下，T淋巴細胞及亞群數目處于較穩定的狀態，當T淋巴細胞呈高表達則哮喘患者氣道炎癥發生變化。相關研究證實，哮喘氣道炎癥的發病機制還包括Treg數目的變化［15］。當哮喘患者接觸到過敏原后，體內Treg數目明顯發生變化，但各研究團隊對Treg變化趨勢的研究結果不一致。XIN等［16］研究顯示，Treg在輕度和中度哮喘患者中數目呈增多趨勢，且會根據病情的加重而增多。STELMASZCZYK-EMMEL等［17］研究發現，Treg在兒童過敏性哮喘患者中呈減少趨勢，但在不同病情與年齡段Treg表達水平不同。本研究發現哮喘組患者Treg/Th17下降，提示哮喘患者存在Treg/Th17細胞失衡現象，Th17細胞數量增多是引起Treg/Th17細胞失衡的主要因素。

FeNO是當氣道受到炎癥或炎癥因子刺激時所合成產生的，在哮喘患者中FeNO值明顯升高，FeNO值可在一定程度上反映氣道炎癥水平［18-19］。氣道炎癥的深層原因與Treg/Th17細胞的失衡相關，目前國內外對Treg/Th17細胞失衡與FeNO相關性尚無相關研究報道。本研究發現，哮喘患者FeNO值與外周血中Treg/Th17細胞比值呈負相關，表明FeNO值在一定程度上反映哮喘患者體內Treg/Th17細胞失衡。當哮喘患者接觸過敏原后，受到刺激的Th17細胞活化生成IL-17，兩者共同誘導嗜酸性粒細胞釋放趨化因子，從而使氣道炎癥持續，FeNO作為炎癥反應的產物隨之升高。Th17細胞在哮喘患者呈高表達，同時FeNO值也呈高表達，兩者呈正相關，進一步表明FeNO值及Th17細胞水平升高與哮喘發病相關，可作為哮喘氣道炎癥發病機制中的重要指標之一。

綜上所述，FeNO水平的升高與Treg/Th17細胞失衡密切相關，尤其與Th17細胞增加的關系更加密切，患者Th17細胞升高導致氣道炎癥發生，進一步導致FeNO值上升，為哮喘的診治提供新的依據，FeNO水平可作為診斷哮喘或預測哮喘發作的指標，而Th17細胞增高導致FeNO值隨之升高的機制尚需進一步研究。