新型冠狀病毒非結構蛋白3結構和功能的生物信息學分析

丁一，宋峰，劉爍，江亞娟，王小羽，焦伯延

濟寧市疾病預防控制中心，山東 濟寧 272000

0 引言

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的一類呼吸道傳染病，新型冠狀病毒屬于冠狀病毒科β屬冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，全長約30kb，含有12個開放讀碼框（open reading frame，ORF）[1-2]。主要合成非結構蛋白（nonstructural protein，NSP）的ORF1a/b可翻譯2種多聚蛋白（polyprotein，pp）1a和1ab，pp1a和pp1ab在NSP3和NSP5催化下分解成16個非結構蛋白[3]。NSP3是新型冠狀病毒最重要的非結構蛋白之一，不僅含有的木瓜樣蛋白酶（Papain-Like proteases，PLpro）活性，參與pp1a和pp1ab蛋白的裂解，還可以結合NSP4參與病毒復制，結合核衣殼蛋白參與病毒組裝，并且可以抑制宿主干擾素（interferon，IFN）信號通路，抑制宿主對新冠病毒的免疫清除[3-5]。然而NSP3的結構功能仍需要進一步闡明。本研究利用生物信息學方法，分析NSP3的性質，為新冠肺炎的致病研究和藥物研發提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

在NCBI數據庫下載2019-nCoV的NSP3序列，序列號NC_045512.2。

1.2 方法

利用ProtParam分析NSP3的理化性質；利用ProtScale分析親水性和疏水性；利用TMHMM分析跨膜結構域；利用POLYVIEW-2D分析二級結構和相互作用位點；分別利用NetPhos 3.1、NetNGlyc、NetOGlyc、NetCGlyc、iUbiq-Lys、GPSSUMO、HybridSucc、CSS-Palm、GPS-PAIL分析NSP3的磷酸化位點、N糖基化位點、O糖基化位點、C甘露糖基化位點、泛素化位點、類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）化位點、琥珀酰化位點、棕櫚酰化位點、乙酰化位點；利用SignalP-5.0分析信號肽；利用Cyscon分析二硫鍵；利用 PSORT分析亞細胞定位；利用pfam和NCBI服務器CDD分析結構域；利用phyre2進行同源建模構建三級結構；利用IEBD服務器Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0和CD4 Immunogenicity prediction分析B細胞表位和CD4細胞抗原表位，利用NetCTL-1.2分析細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）抗原表位。

2 結果

2.1 NSP3的理化性質

NSP3由1945個氨基酸組成，含量最高的是亮氨酸（占9.2%），含量最低的是色氨酸（占0.9%），帶正電荷氨基酸（精氨酸和賴氨酸）185個，帶負電荷氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）222個，見圖1。分子式為C9722H15175N2489O2969S88，相對分子量217252.61，理論等電點為5.56，不穩定系數為36.56，半衰期為4.4h。說明NSP3是穩定蛋白質。

圖1 NSP3 氨基酸組成分析

2.2 NSP3的親/疏水性和跨膜結構域分析

利用 ProtScale軟件分析NSP3的親/疏水性，位于第409位的谷氨酰胺親水性最強，為-3.744；第1415位的苯丙氨酸疏水性最強，值為2.889；平均親水性系數為-0.175。利用TMHMM分析NSP3的跨膜結構域，發現NSP3含有4個跨膜結構域，分別是：1413-1435，1500-1522，1532-1554，1561-1583（見圖2）。說明NSP3是含跨膜結構域的親水蛋白。

圖2 NSP3 跨膜結構域分析

2.3 NSP3二級結構和相互作用位點分析

利用POLYVIEW-2D軟件分析NSP3二級結構和相互作用位點，結果顯示NSP3共含有57個α-螺旋，91個β-折疊，138個無規卷曲；其中α-螺旋氨基酸占34.0%（661/1945），β-折疊氨基酸占20.9（406/1945），無規卷曲氨基酸占45.1%（878/1945）。此外，NSP3含有93個主要的蛋白相互作用氨基酸位點。

2.4 NSP3翻譯后修飾分析

利用NetPhos 3.1分析NSP3的磷酸化位點，發現NSP3共有199個潛在磷酸化位點，包括79個絲氨酸、83個蘇氨酸、37個酪氨酸可能被磷酸化（見圖3）。利用NetNGlyc、NetOGlyc、NetCGlyc分析NSP3的N糖基化、O糖基化、C甘露糖基化位點，發現NSP3含有11個N糖基化位點、14個O糖基化位點，無甘露糖基化位點（見表1）。

圖3 NSP3 磷酸化位點分析

此外，NSP3含有3個泛素化位點、15個SUMO化位點、6個琥珀酰化位點、1個棕櫚酰化位點、2個乙酰化位點（見表1）。利用GPS-Lipid分析肉豆蔻酰化位點、法尼基化位點、牻牛兒酰牻牛兒基化位點，發現NSP3無肉豆蔻酰化位點、無法尼基化位點、無牻牛兒酰牻牛兒基化位點。

2.5 NSP3信號肽、二硫鍵和細胞定位分析

SignalP-5.0分析NSP3的信號肽，顯示NSP3無信號肽序列。Cyscon分析二硫鍵，發現NSP3含有15個二硫鍵（見表1）。PSORT分析亞細胞定位，NSP3主要分布于內質網。

表1 NSP3 翻譯后修飾分析

2.6 NSP3的結構域和三級結構分析

利用NCBI服務器CDD軟件和pfam軟件分析NSP3的結構域，兩種軟件分析結果基本一致，NSP3含7個保守結構域，見圖4。利用phyre2預測NSP3的三級結構，NSP3 675-1053與c4yptA序列相似度100%，覆蓋率19%，能夠以c4yptA為模板進行同源建模構建NSP3三級結構（見圖5）。

圖4 NSP3 結構域分析

圖5 NSP3 三級結構分析

2.7 NSP3抗原表位分析

利用IEBD服務器Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0分析NSP3的B細胞抗原表位，N端B細胞抗原表位較豐富，特別是109-217區域抗原性最強。利用IEBD服務器CD4 Immunogenicity prediction分析CD4 T細胞抗原表位，大于90分區域19個，其中1746-1760區域抗原性最強，得分為99.39。利用NetCTL-1.2分析NSP3 CTL抗原表位，大于1.25分區域24個，其中503-511區域抗原性最強，得分為3.72。說明NSP3含有豐富的抗原表位。

3 結論

本研究利用生物信息學方法獲得2019-nCoV NSP3的理化性質、跨膜結構域、亞細胞定位、翻譯后修飾位點、三級結構、抗原表位等分析結果。理化性質分析顯示，NSP3全長1945個氨基酸，其中亮氨酸含量最高，帶負電荷氨基酸較多，含4個跨膜結構域，是可以定位于胞膜的穩定的親水蛋白。二級結構無規卷曲含量最高，多達45.1%。無規卷曲常位于蛋白質表面，是蛋白質結合抗體、行使功能的主要結構[6]。NSP3含有15對二硫鍵，二硫鍵能夠促進蛋白正確折疊和維持蛋白結構的穩定[7]，NSP3的二硫鍵對其三級結構的折疊形成和穩定可能至關重要。

NSP3無信號肽，主要定位于內質網，但囊泡、線粒體、細胞核、液泡和細胞質也有一定的分布。蛋白質翻譯后通常需要修飾后才能形成成熟蛋白質[8]。磷酸化、糖基化、脂酰化、泛素化等修飾對蛋白質的亞細胞定位、調節、代謝、功能和降解至關重要[9]。NSP3含有199個磷酸化位點、25個糖基化位點、15個SUMO化位點、2個乙酰化位點和7個脂酰化位點，說明NSP3的成熟需要復雜的修飾，NSP3可能具有較強的生物學活性。此外，NSP3含有3個泛素化位點，蛋白酶體能夠降解泛素化修飾蛋白[10]，說明宿主可以通過泛素-蛋白酶體途徑降解NSP3。

NSP3是新型冠狀病毒氨基酸含量最多的成熟蛋白質，含有7個功能結構域，其中746-1064是NSP3的PLPro結構域，是裂解pp1a和pp1ab蛋白的核心區域。病毒蛋白酶具有與宿主蛋白酶不同的結構，針對病毒蛋白酶的抑制劑是治療RNA病毒感染的最重要特異性藥物[11-12]。PLPro結構域是治療COVID-19藥物研究的最重要靶點之一[13]。本研究對NSP3三級結構的分析和木瓜樣蛋白酶結構域的確定將為PLPro抑制劑的研發制備提供研究依據。

本研究利用多參數分析方法分析NSP3含有多個B細胞抗原表位和T細胞抗原表位，說明NSP3具有較強的免疫原性。109-217區域B細胞抗原性最強，這一區域可能能夠作為新冠肺炎抗體檢測的靶標和疫苗研發的候選序列。此外，NSP3含有數量豐富的抗原性較強的CTL抗原表位，說明NSP3可能能夠引起較強的T細胞免疫反應，宿主T細胞免疫反應的激活能夠使感染2019-nCoV的細胞凋亡，但同時可能引起宿主發生炎癥反應和細胞因子風暴[14-17]。NSP3豐富的抗原表位可能與宿主的免疫清除和肺炎的發生相關。

綜上所述，本研究對NSP3生物信息學分析，將有助于進一步了解NSP3的生物學功能，為深入了解2019-nCoV的生活史、致病性及宿主免疫提供理論基礎，為檢測試劑和抗病毒藥物的研究提供參考數據。