LncRNA CCAT1在青少年高血壓篩查中的效果及靶向miR-181a促使高血壓并發血管疾病的產生

馬星星，田朝霞，李紅梅，田威威，趙娜，薛曉燕

山西醫科大學 汾陽學院，山西 汾陽 032200

0 引言

高血壓是目前全球范圍內最為常見的心腦血管疾病，多見于中老年人[1]。據統計，全球每年新增高血壓患者已經高達6.38%～6.54%[2]，且這一數字隨著全球老齡化的發展更是有增無減[3]。目前，高血壓的發病機制尚未完全明確，研究表明肥胖、飲食習慣、代謝、遺傳等多種情況均可能引發高血壓[4]。近年來，隨著高血壓的發展，青少年患病情況日益嚴重[5]。且青少年高血壓通常伴隨隱匿性極高、典型病癥少的特點，約超過75%的青少年患者未被診斷出來[6]。高血壓的存在，極易引起機體組織中的多數器官、組織的病變壞死，其中以心血管疾病最為常見也最為嚴重[7]。心力衰竭、冠心病即是高血壓極常見的繼發疾病，一旦患者沒有得到及時的有效治療，則有極大可能性造成心肌梗塞、梗死的情況，直接威脅患者的生命健康[8]。

雖然血壓檢測是判斷高血壓最直觀的指標，但對于隱匿性極強的青少年高血壓，可能存在無法鑒別的情況[9]。且由于血壓檢測無法實現一直動態檢測，因此對于青少年高血壓的早期篩查仍存在諸多局限性。找到一種可靠的血液標志物，仍是青少年高血壓早期篩查的關鍵。近年來，國內外研究學者將目光聚焦在了長鏈非編碼RNA（LncRNA）上，如LncRNA AK094457、TUG1等，均被發現在高血壓中存在異常表達[10-11]。我們發現，LncRNA CCAT1是一種在白血病、多項心腦血管疾病中具有重要作用的基因[12-13]，且對于血管炎癥反應有著重要調控作用[14]。目前，CCAT1在高血壓中的情況尚無研究證實，而我們卻發現CCAT1可以通過miR-181a參與口腔癌的發生[15]，而miR-181a是一種已被證實在高血壓中具有重要作用的基因[16]。于是我們推測，CCAT1可能同樣與高血壓的產生有著密切關系。為了證實我們的猜想，以及為未來臨床篩查青少年高血壓提供新的參考依據，本次研究將對CCAT1在高血壓中的作用展開分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取山西醫科大學汾陽學院附屬三甲醫院2019年8月-2021年1月收診高血壓患者56例為觀察組。納入標準：相關檢查后確診為高血壓疾病；年齡12～18歲。排除標準：排除既往有嚴重心血管疾病史患者；排除合并其他心腦血管疾病、自身免疫性缺陷、感染性疾病、腫瘤疾病患者；排除器官衰竭功能不全患者；排除藥物過敏患者；排除入院前半年內接收了抗生素類藥物、手術、放化療治療患者。另選取同時期健康體檢者65例為對照組，納入排除標準：年齡12～18歲；擁有完整病例資料，既往無重大病史；體檢結果均正常。抽取兩組入院時空腹靜脈血液5mL，離心取得血清后進行后續檢測。本次實驗已獲得山西醫科大學汾陽學院倫理委員會批準（批準號：2022007），以上所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 qRT-PCR檢測

取得待測血清，使用TRIzol（美國Invitrogen）提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書（日本TaKaRa，PrimeScriptTM RT reagent Kit）逆轉錄為cDNA，以GAPDH與U6為內參（引物序列由美國Invitrogen完成，見表1），進行擴增（日本TaKaRa，TB Green? Fast qPCR Mix）。反應條件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 1min，共35個循環，2-△△ct計算相對表達量，見表1。

表1 引物序列

1.3 細胞資料

人冠狀動脈平滑肌細胞HCASMC、人心肌細胞AC16購買自中國北納生物科技，使用90%高糖DMEM與10%FBS的培養基，在5%CO2、37℃的環境下進行培養。

1.4 細胞轉染

細胞接種于1 2 孔板，當細胞長滿孔底80%時，使用Lipofectamine（美國Invitrogen，Lipofectamine?2000）分別將轉染過表達CCAT1載體（sh-CCAT1組）、靶向沉默CCAT1載體（si-CCAT1組）、CCAT1空載體（NC-CCAT1組）及miR-181a模擬物序列（miR-mimics組）、miR-181a抑制物序列（miR-inhibitor組）、miR-181a陰性對照（miR-NC）轉染至HCASMC、AC16中。

1.5 細胞增殖能力檢測

轉染后細胞接種于96孔板（0.25×104個/孔），每孔200μL。24h、48h、72h、96h時，加入10μLCCK-8試劑（中國Biosharp），避光孵育2h。酶標儀（美國Invitrogen，Multiskan? FC 酶標儀）測量各孔吸光度值（450nm）。

1.6 細胞凋亡能力檢測

胰酶消化轉染后細胞，PBS調整細胞為1×106個/mL，離心10min（500個重力加速度），除去殘余液體，加入Binding buffer 500μL重懸。避光環境下加入Annexin V-FITC（美國BD）、PI各5μL，充分振蕩混勻，室溫下靜置30min，流式細胞儀（美國Beckman Coulter，CytoFLEX流式細胞儀）檢測細胞凋亡率。

1.7 雙熒光素報告酶實驗

使用在線靶基因預測網站ENCORI（http://starbase.sysu.edu.cn/）分析CCAT1與miR-181a的序列關系。構建野生型CCAT1（CCAT1-WT）及缺失miR-181a結合區域的突變體CCAT1（CCAT1-MUT）。分別將CCAT1-WT與CCAT1-MUT熒光素報告載體與miR-181a模擬物序列、陰性對照共轉染至細胞中，48h后使用雙熒光素報告酶試劑盒（上海滬震實業）檢測熒光素酶活性。

1.8 拯救實驗

將過表達CCAT1載體與miR-181a模擬物序列共轉染至細胞中，設為A組；另將單獨轉染過表達CCAT1載體的細胞設為B組；轉染CCAT1空載體的細胞設為C組，比較3組細胞生物學行為變化。

1.9 統計學方法

SPSS 22.0軟件進行統計學分析；Graphpad8軟件進行圖形繪制。所有實驗均重復3次，結果以（均數±標準差）的形式記錄，組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析及LSD事后組內檢驗；多個時間點比較采用重復測量方差分析以及bonferroni事后組內檢驗；預測價值采用ROC曲線分析；當P＜0.050時認為該組數據存在統計學差異。

2 結果

2.1 CCAT1對青少年高血壓的篩查效果

觀察組血清中CCAT1為（3.18±0.62），高于對照組血清中CCAT1（P＜0.05）；ROC曲線分析顯示，當血清中CCAT1＞2.92時，預測高血壓發生的靈敏度為66.07%，特異度為78.46%（P＜0.05），見圖1。

圖1 CCAT1 對青少年高血壓的篩查效果

2.2 CCAT1的作用效果

首先，檢測CCAT1表達水平發現sh-CCAT1組最高，si-CCAT1組最低（P＜0.05），證實轉染成功。生物學行為檢測結果顯示，在HCASMC中，sh-CCAT1組增殖能力最強，凋亡率最低，si-CCAT1組增殖能力低于NC-CCAT1組，凋亡率高于NC-CCAT1組（P＜0.05）；而在AC16中，sh-CCAT1組增殖能力最低，凋亡率最高，si-CCAT1組增殖能力高于NC-CCAT1組，凋亡率低于NCCCAT1組（P＜0.05），見圖2。

圖2 CCAT1 的作用效果

2.3 miR-181a的作用效果

同樣，檢測miR-181a表達水平發現miRmimics組最高，miR-inhibitor組最低（P＜0.05），證實轉染成功。生物學行為檢測結果顯示，在HCASMC中，miR-mimics組增殖能力最低，凋亡率最高，miR-inhibitor組增殖能力高于miR-NC組，凋亡率低于miR-NC組（P＜0.05）；而在AC16中則反之（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-181a 的作用效果

2.4 CCAT1與miR-181a的關系驗證

首先，我們通過ENCORI發現CCAT1與miR-181a存在可結合的互補位點，隨后通過雙熒光素報告酶實驗發現在HCASMC與AC16細胞，CCAT1-WT的熒光活性均受到miR-181a模擬物的抑制（P＜0.05）。而檢測轉染了過表達CCAT1載體、靶向沉默CCAT1載體及CCAT1空載體后的HCASMC、AC16中miR-181a表達情況可知，sh-CCAT1組均最低，而si-CCAT1組高于NC-CCAT1組（P＜0.05），見圖4。

圖4 CCAT1 與miR-181a 的關系驗證

2.5 拯救實驗

A組與C組增殖、凋亡能力均無差異（P＞0.05），HCASMC中B組增殖能力高于其他兩組，而凋亡率低于其他兩組（P＜0.05）；AC16中B組增殖能力低于其他兩組，而凋亡率高于其他兩組（P＜0.05），見圖5。

圖5 拯救實驗

3 討論

高血壓作為全球發病率最高的血管疾病，其潛在威脅必須引起臨床的重視[17-18]。對于青少年高血壓而言，可能由于患者的機體功能處在較好的階段，很長一段時間內不會表現出病理改變。而心腦血管長期處在高血壓的狀態下，一旦發病可能將造成比中老年高血壓患者更為嚴重的后果[19]。因此，對于青少年高血壓的早期篩查是重中之重。而本次研究通過探究CCAT1對青少年高血壓的篩查效果以及對并發疾病的初步機制探究，可以為將CCAT1作為青少年高血壓血液標志物的后續研究提供堅實的基礎。

本次研究首先對青少年高血壓患者與健康體檢者外周血中CCAT1進行了檢測，發現CCAT1在高血壓中呈高表達，提示CCAT1可能參與了高血壓的發生、發展。而這也與既往研究中對CCAT1的相關研究的情況一致[20-24]。隨后，通過ROC曲線分析，本研究發現CCAT1對于預測高血液的發生的靈敏度為66.07%，特異度為78.46%，這也提示CCAT1具有成為未來高血壓血液標志物的潛力。目前，高血壓的診斷仍主要依靠血壓檢測儀，無法實現大范圍的臨床篩查。而血液標志物的出現，不僅可以有效彌補這一缺陷，還更加方便、快捷、迅速，降低人工成本，具有更高的經濟效應。但是，對于ROC曲線的分析結果，需要大量的臨床數據才可以獲取最佳的cut-off截值，而本次研究中僅納入了總共121例對象，不排除結果可能存在一定誤差。

綜上所述，CCAT1在青少年高血壓中呈高表達，具有成為青少年高血壓血液標志物的潛力；CCAT1可通過靶向miR-181a促進HCASMC活化與AC16的凋亡引起冠心病、心力衰竭等疾病的發生。但是，本次研究仍存在不足之處有待改進。如我們本次研究中僅針對HCASMC與AC16展開了分析，對于CCAT1與其他高血壓并發疾病的關系還不清楚；且對于CCAT1的作用機制，還值得我們進行更深入的實驗以確認。此外，我們還需要擴大研究樣本，進行大數據的分析，進一步體現出CCAT1對青少年高血壓的篩查效果。