連花解毒合劑解熱、抗炎、止咳及祛痰作用的實驗研究

葉曉楠，朱路文，亢玉瑩，梁潤昱，王琳晶，李書霖，王有鵬，唐強*

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第四醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；3黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

新型冠狀病毒肺炎，簡稱“新冠肺炎”，WHO將其命名為2019冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019,COVⅠD?19），其病原體為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS?CoV?2）[1]。其早期臨床癥狀以發熱、干咳、乏力為主要表現，少數患者可伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀，臨床分為輕型、普通型、重型、危重型。經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是其主要傳播途徑[2?3]。連花解毒合劑是我院專家組根據國家衛健委、國家中醫藥管理局《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》（試行第三版）及《黑龍江省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫藥防治方案（試行）》，探討并制定的新型冠狀病毒肺炎的中醫預防方案（院內協定方），該方由連翹、金銀花、白術、佩蘭、桑葉、桔梗和甘草[4?5]7味中藥組成，具有清熱解毒、健脾化濕、宣肺利咽的功效，用于風熱、濕熱類的溫病所致的發熱頭痛、咳嗽痰多、咽喉腫痛、氣短、動輒汗出者。在疫情期間，廣泛應用于臨床上的中青年人群，具有良好的臨床基礎，目前正在將其開發成院內制劑。為了進一步明確連花解毒合劑的藥理作用，本文進行了連花解毒合劑的解熱、抗炎、止咳以及祛痰作用的研究[6?8]，為連花解毒合劑的進一步研制及臨床應用奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016?0006；SPF級ⅠCR小鼠，購自遼寧長生實驗動物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2020?0001。飼養環境：溫度23~25℃，濕度55%~65%，人工光照12 h∶12 h明暗交替。實驗期間，動物自由飲食與飲水。

1.2 藥物與試劑

連花解毒合劑（由黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院制劑室提供，批號：20200722），每1.0 mL合劑相當于生藥0.5 g；阿司匹林泡騰片（阿斯利康，批號：1905213）；氫溴酸右美沙芬片（石家莊以嶺藥業股份有限公司，A1910011）；高活性干酵母（安琪酵母有限公司，批號：20200418）；碳酸氫鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：201909）；苯酚紅（天津市天新精細化工開發中心，批號：20191211）；氯化銨（天津市天力化學試劑有限公司，批號20200122）；二甲苯（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20190505）；氨水（天津市恒興化學試劑制造有限公司，批號：20191215）；凡士林（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20190101）。

1.3 主要儀器

FA2004分析天平（SOPTOP/舜宇恒平儀器）；TGL?16E臺式高速冷凍離心機（YⅠNGTAⅠ）；電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）；Synergy MX型酶標儀（BⅠO TEK公司）；YP5002電子天平（常州市衡正電子儀器有限公司）；LY?301C電子體溫計（北京綠源恒泰醫療器械有限公司）。

2 方法

2.1 解熱作用：酵母致大鼠發熱實驗

Wistar大鼠，體質量180~200 g，雌雄各半，適應環境3 d，于第4天起，每天早晚2次對大鼠實行適應性測量肛溫，測量前用凡士林涂抹于大鼠肛門周圍，待大鼠排空糞便后將體溫計插入大鼠肛門，保持每次插入深度一致，連續測量3 d，2次/d，篩選出體溫波動不超過0.5℃，平均體溫在36.6~38.3℃的動物作為實驗對象。正式實驗前禁食不禁水12 h，實驗當日上午每隔1 h測體溫1次，連續測2次，取平均值為基礎體溫。隨機抽取雌雄大鼠各5只大鼠作為空白對照組，除空白對照組外，其他組均背部皮下注射20%干酵母懸液10 mL/kg，空白對照組背部皮下注射等體積的生理鹽水[9?13]。致熱6 h后，選取體溫升高0.8℃以上的50只大鼠，將雌雄動物各隨機分為連花解毒合劑低、中、高劑量組（1.8、3.6、7.2 g/kg）、模型組、阿司匹林組（陽性藥組，0.2 g/kg），每組10只（雌雄各半）。各給藥組灌胃給予相應的藥物，空白對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。分別于給藥后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h測定記錄各組大鼠體溫。按公式計算各組大鼠在各時間點的體溫升溫值ΔT。

2.2 抗炎作用：二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗

雄性ⅠCR小鼠50只，體質量18~20 g，適應環境3 d，按體質量隨機分為連花解毒合劑低、中、高劑量組（2.6、5.2、10.4 g/kg）、模型組、陽性藥組（阿司匹林，0.2 g/kg），每組10只。每天灌胃給藥1次，連續7 d，模型組給予等體積蒸餾水。正式試驗前禁食不禁水12 h，末次給藥0.5 h后，取二甲苯50μL均勻涂于小鼠右耳廓內外，0.5 h后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下2耳，用直徑8 mm打孔器分別在同一部位打下雙耳片，精密稱質量，以兩耳片質量之差作為腫脹度[14?17]，并按公式計算腫脹度抑制率（%）。腫脹度抑制率=

2.3 止咳作用：濃氨水引咳實驗

ⅠCR小鼠50只，體質量18~20 g，雌雄各半，適應

環境3 d，實驗動物分組及給藥方式同“2.2”，僅陽性藥組小鼠改為灌胃給予氫溴酸右美沙芬（18 mg/kg），連續給藥7 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥0.5 h后，進行濃氨水引咳，將小鼠放入倒置于桌面的500 mL玻璃鐘罩內，用移液槍將0.5 mL濃氨水（25%氫氧化銨）滴于棉球上（100±5）mg，置于鐘罩內引咳30 s后立即取出，觀察小鼠的咳嗽反射（腹肌收縮，張大嘴，有時有咳嗽聲），記錄從放入小鼠到小鼠發生咳嗽反射的時間即咳嗽潛伏期和2 min內小鼠的咳嗽次數，并按公式計算咳嗽抑制率[18?20]。

咳嗽抑制率=

2.4 祛痰作用：小鼠氣管酚紅排泄實驗

ⅠCR小鼠50只，體質量18~20 g，雌雄各半，適應環境3 d，實驗動物分組及給藥方式同“2.2”，僅陽性藥組小鼠改為灌胃給予氯化銨（1 g/kg），連續給藥7 d。末次給藥前禁食不禁水16 h，末次給藥0.5 h后，腹腔注射2.5%酚紅生理鹽水溶液0.2 mL/10 g，注射0.5 h后，頸椎脫臼處死動物，仰位固定，頸部拉直，解剖分離出氣管，剪下自甲狀軟骨至氣管分支處的一段相同長度的氣管，放入盛有2 mL 5%的NaHCO3的試管中，超聲30 min，2 000 r/min離心5min，取上清液，用酶標儀于546 nm處測定吸光度（A）值[21?25]。

2.5 統計學方法

采用SPSS25.0統計學軟件進行數據分析，實驗數據均以表示。采用單因素方差分析比較各組間、組內差異，方差齊者用LSD?t檢驗比較兩兩之間差異，不齊者則用Tamhane'sT2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 連花解毒合劑對酵母致大鼠發熱的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠在致熱6 h后，體溫顯著升高（P＜0.01），升溫約1.27℃，提示大鼠發熱模型建立成功。與模型組相比，給藥后各時間點，阿司匹林和連花解毒合劑高劑量組大鼠的ΔT值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），連花解毒合劑中、低劑量組大鼠的ΔT值分別在在給藥后2~5 h顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 連花解毒合劑對酵母所致大鼠發熱的影響Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast?induced fever in rats （±s，n=10）

表1 連花解毒合劑對酵母所致大鼠發熱的影響Table 1 Effect of Lianhuajiedu mixture on yeast?induced fever in rats （±s，n=10）

與空白對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.2 連花解毒合劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

與模型組相比，陽性藥組（阿司匹林）、連花解毒合劑中、高劑量組小鼠耳腫脹度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。陽性藥組小鼠的腫脹度抑制率為61.43%，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠的腫脹度抑制率分別為13.21%、24.64%、36.64%，見圖1。

圖1 連花解毒合劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Figure1 Effect of Lianhuajiedu mixture on ear swelling in mice(±s,n=10)

3.3 連花解毒合劑對濃氨水致咳小鼠的影響

與模型組比較，陽性藥組（氫溴酸右美沙芬）和高劑量的連花解毒合劑對小鼠咳嗽的潛伏期有顯著的延長作用（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥組、連花解毒合劑各劑量組小鼠2 min內咳嗽次數顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），且各劑量組呈現較好的量效關系。陽性藥組小鼠的咳嗽抑制率為50.55%，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠的咳嗽抑制率分別為24.18%、32.97%、和37.36%，見圖2。

3.4 連花解毒合劑對小鼠氣管酚紅排泌量的影響

與模型組相比，陽性藥組（氯化銨）、連花解毒合劑中、高劑量組小鼠氣管酚紅排泌量明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），連花解毒合劑低劑量組小鼠氣管酚紅排泌量也有增加的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 連花解毒合劑對小鼠氣管酚紅排泌量的影響Figure 3 Effect of Lianhuajiedu mixture on excretion of phenol red in mice(±s,n=10)

4 討論

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》將新冠肺炎歸屬于“疫”病范疇。“疫”病是古代醫學對烈性傳染病的總稱。專家對新冠肺炎感染者的臨床特點分析指出：患病者癥狀出現頻率較高的是發熱、倦怠乏力、干咳、納呆、口干、腹瀉等，基本符合中醫學中疫病的臨床特點[26?27]。連花解毒合劑為我院院內協定方，該方以抗邪氣、祛疫濁為主略兼調暢氣機為總旨，功能清熱解毒、健脾化濕、宣肺利咽。本研究結果表明，在酵母致大鼠發熱模型中，連花解毒合劑高劑量組在給藥后1~5 h，大鼠體溫均顯著下降，降溫作用持續時間較長；連花解毒合劑低劑量組在給藥后2 h，與模型組相比，體溫顯著降低，但持續時間較短。發熱與炎癥密切相關，且炎癥表現可能參與外感及肺炎癥狀的全過程[28]。本研究在確定了連花解毒合劑具有解熱作用的基礎上，進行了二甲苯致小鼠耳腫脹實驗，結果表明，連花解毒合劑中、高劑量組與模型組相比，腫脹度顯著降低，表現出良好的抗炎效果。在小鼠氣管酚紅排泌實驗中，連花解毒合劑中、高劑量組與模型組相比，小鼠氣管酚紅排泌量顯著增加，提示本藥具有較好的祛痰作用。此外，在小鼠濃氨水引咳實驗中，連花解毒合劑低、中、高劑量組小鼠咳嗽次數顯著減少，且高劑量組小鼠的咳嗽潛伏期顯著縮短，表明連花解毒合劑有良好的止咳效果。

綜上所述，連花解毒合劑具有明顯的解熱、抗炎、止咳以及祛痰作用。本研究為連花解毒合劑的功效主治提供了實驗依據和科學闡釋，但其藥理作用機制尚待進一步研究。