茯苓酸對LPS誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用及機制

陳云，王婷婷，郝明明，胡立杰

（1.衡水市第四人民醫院兒科，河北 衡水 053000；2.衡水市人民醫院小兒內科，河北 衡水 053000；3.衡水市第四人民醫院藥劑科，河北 衡水 053000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALⅠ）是一種嚴重的呼吸系統疾病，以快速肺泡損傷、嚴重低氧血癥、血管通透性增加以及不可控的炎癥反應為病理表現，嚴重可發展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），是臨床上導致多器官衰竭和高死亡率的主要原因之一[1?2]。盡管當前醫療和衛生保健水平已有所改善，但針對ALⅠ尚缺乏特異性和有效的治療方法。因此，尋找新的有效的治療藥物對提高ALⅠ治療水平具有重要意義。天然產物是發現新藥化合物的主要來源之一。茯苓酸（pachymic acid,PA）是從中藥茯苓中提取的蒽酮型三萜化合物。PA被報道具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[3?5]。在體外實驗研究中，PA可以抑制H2O2誘導的腦微血管細胞凋亡[6]。PA對ALⅠ是否具有保護作用尚不清楚。本研究旨在觀察PA對脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）誘導的巨噬細胞活化以及ALⅠ模型小鼠的保護作用，并初步探討其作用機制，以期為臨床ALⅠ的治療尋找新的潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗動物

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7（武漢普諾賽生命科技有限公司），肺巨噬細胞參照文獻[7]方法取自雄性C57BL/6小鼠，即處死小鼠后剝離肺葉，使用1.0 mg/mL膠原酶、25 U/mL脫氧核糖核酸酶從小鼠全肺中分離巨噬細胞。收集細胞，在含有10%（φ）胎牛血清的DMEM培養基中于37℃，5%（φ）CO2培養箱中1 h后，沖洗掉未貼壁細胞。健康雄性新C57BL/6小鼠36只，6~8周齡，購自河北省實驗動物中心，生產許可證號SCXK（冀）2021?001。本實驗根據實驗動物管理與保護的有關規定飼養動物并進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

PA（質量分數＞98%，中國藥品生物制品檢定所）；LPS（美國Sigma公司）；Western blot一抗（美國CST公司）；HRP標記的羊抗兔ⅠgG二抗（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；NO檢測試劑盒（Abbkine公司）；MPO比色法檢測試劑盒（Biovision公司）；PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（寶生物工程有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（賽默飛世爾科技公司）；Mini?Protean聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（美國Bio?Rad公司）；MK3型酶標免疫分析儀（Biotek公司）。

1.3 細胞培養與處理

收集分離的肺巨噬細胞，在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中于37℃，5%（φ）CO2培養箱中1 h后，沖洗掉未貼壁細胞。根據實驗要求，使用指示濃度的PA和/或LPS處理貼壁細胞。RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，待細胞生長匯合率達80%以上傳代培養。在LPS（100 ng/mL）刺激前30 min，使用相應濃度的PA處理細胞。

1.4 MTT實驗檢測細胞活力

將RAW264.7及肺巨噬細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養基配成單細胞懸液后以5 000個/孔接種于96孔板中，放入溫度為37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后加入不同濃度PA（0、5、10、20、40、80μmol/L）干預，繼續培養48 h后加入20μL的MTT溶液繼續培養4 h后棄去MTT溶液，并加入100μL DMSO，使用酶標儀測定570 nm處各孔的吸光度（A570）值。

1.5 細胞培養上清液NO水平測定

將RAW264.7及肺巨噬細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養基配成單細胞懸液后以5×105個/孔密度接種于12孔板中培養過夜，使用40μmol/L的PA處理細胞30 min，然后使用100 ng/mL的LPS刺激24 h。收集上清液，使用NO測定試劑盒測定NO釋放水平。

1.6 ALⅠ動物模型制備

將36只小鼠適應性喂養2周后，隨機分為Control組、LPS組和LPS+PA組，每組12只。造模當日將小鼠以戊巴比妥麻醉后，LPS組和LPS+PA組小鼠經氣管內滴入5 mg/kg的LPS（以50μL PBS溶解）誘導ALⅠ模型，Control組滴入等量PBS溶液。造模結束后LPS+PA組小鼠經腹腔注射10 mg/kg PA[8]（PA預先使用橄欖油配置成0.5 mg/mL），Control組和LPS組小鼠給予等體積橄欖油注射。在給予LPS后24 h每組取8只小鼠處死。結扎小鼠右肺，行左肺肺泡灌洗并收集肺泡灌洗液，用PBS洗肺2次收集BALF，用裂解緩沖液裂解紅細胞，離心后收集上清液。無菌條件下分離右肺組織，用生理鹽水充分沖洗并吸取表面水分。

1.7 小鼠肺組織HE染色及病理評分

取10%（φ）甲醛溶液固定的右上肺組織，洗滌后進行常規的脫水、透明、包埋和4μm連續切片。將切片采用二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，依次采用蘇木精和伊紅染色，最后中性樹膠封片。在光鏡下觀察肺組織病理改變，每張切片隨機取10個視野觀察，參照Zhang等[9]的方法進行評分，取其平均值為病理評分。

1.8 RT?PCR檢測mRNA表達

使用Trizol試劑從收集的細胞及小鼠肺組織中提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA表達水平，采用2-ΔΔCt法計算RNA相對表達量。

1.9 小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度及肺組織MPO檢測

使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測BALF中總蛋白濃度。取小鼠右下肺組織制備肺組織勻漿，將取好的50 mg肺組織加入冷生理鹽水（體積比1∶9）置于專用試管中，使用勻漿機打勻后，置于離心機以1 500 r/min、4℃條件離心10 min，離心結束后取上清液，使用比色法檢測肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.10 Western blot實驗

BCA法定量提取的細胞或肺組織蛋白后，取適量樣品蛋白經SDS?PAGE電泳轉印至PVDF膜，然后以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，以β?actin為內參，分別加入p38、p?p38、MK2、p?MK2、Akt、p?Akt、p65、p?p65一抗于4℃條件下孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加入二抗（1∶1 000）室溫下孵育2 h，ECL法顯色，采用Ⅰmage J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.11 統計學處理

使用SPSS 20.0統計分析數據，計量資料以表示，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較采取SNK法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PA對RAW264.7細胞和肺巨噬細胞活力的影響

與Control組比較，PA（5~80μmol/L）對RAW264.7細胞系和肺巨噬細胞活力均無明顯不良影響（P＞0.05）。見圖1。在后續實驗中采用40μmol/L PA進行功能實驗研究。

圖1 PA對巨噬細胞活力的影響Figure 1 Effects of PA on the activity of macrophages

2.2 PA對LPS處理的巨噬細胞iNOS表達及NO生成的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞后，iNOSmRNA水平及NO生成增加（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預顯著降低了iNOS水平及NO生成增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組巨噬細胞iNOS表達及NO水平Figure 2 The expression of iNOSand the NO level in macrophages of each group

2.3 PA對LPS處理的巨噬細胞促炎介質和細胞因子表達的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞后，TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預顯著降低了TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組巨噬細胞促炎細胞因子水平Figure 3 The levels of pro?inflammatory cytokines in macro‐phages of each group

2.4 PA對LPS處理的巨噬細胞p38 MARK/Akt/NF?κB信號通路的影響

與Control組比較，使用LPS處理RAW264.7細胞和肺巨噬細胞顯著促進p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白的磷酸化（P＜0.05）；與LPS組比較，PA干預顯著抑制p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白的磷酸化（P＜0.05）。見圖4。

圖4 PA對LPS處理的RAW264.7細胞系和原代肺巨噬細胞p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白表達的影響Figure 4 Effects of PA on the expressions of p38，MK2，Akt and NF?κB（p65）proteins in LPS?treated RAW264.7 cell line and primary lung macrophages

2.5 PA對LPS誘導的小鼠ALⅠ的影響

HE染色后光鏡下可見Control組小鼠肺組織結構正常，肺泡腔清晰、形態規則，肺泡及間質無明顯充血、滲出及炎癥細胞浸潤；與Control組比較，LPS組小鼠肺泡壁毛細血管充血、擴張明顯，肺泡腔和肺組織間隙滲出明顯且較多炎性細胞浸潤，肺組織病理評分顯著增加（P＜0.05），肺泡灌洗液中總蛋白濃度及肺組織MPO水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，LPS+PA組肺組織損傷情況減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，病理評分降低（P＜0.05），肺泡灌洗液中總蛋白濃度及肺組織MPO水平均顯著降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織損傷情況Figure 5 The damage of lung tissuesfrom mice in each group

2.6 PA對LPS誘導的ALⅠ小鼠促炎介質、細胞因子及p38 MARK/Akt/NF?κB信號通路的影響

RT?PCR檢測結果顯示，與Control組比較，LPS組 小 鼠 肺 組 織iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA水平均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，PA干預顯著降低了肺組織iNOS、TNF?α、ⅠL?6、ⅠL?1β、ⅠL?12 mRNA（P＜0.01）。見圖6。

圖6 RT?PCR檢測各組小鼠肺組織促炎細胞因子水平Figure 6 The levels of pro?inflammatory cytokines in lung tissues of each group

Western blot實驗檢測結果顯示，與Control組比較，LPS組小鼠肺組織p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）的磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）；與LPS組比較，PA干預顯著抑制p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）的磷酸化（P＜0.05）。見圖7。

圖7 PA對LPS誘導的ALⅠ小鼠肺組織p38、MK2、Akt和NF?κB（p65）蛋白表達的影響Figure 7 Effects of PA on expressions of p38，MK2，Akt and NF?κB（p65）proteins in lung tissues of mice with LPS?induced ALⅠ

3 討論

ALⅠ是重癥監護病房患者發病率和死亡率的主要原因之一。炎癥細胞浸潤增強的炎癥反應和肺內促炎細胞因子表達升高是ALⅠ發病的關鍵因素[10]。炎癥通常被認為是對包括微生物感染在內的各種攻擊的一種防御反應，然而過度炎癥往往會導致廣泛的組織損傷、急性呼吸衰竭、全身功能障礙甚至死亡。越來越多的證據表明巨噬細胞在炎癥反應中起著至關重要的作用，作為抵抗感染的第一道防線，其釋放多種促炎介質，并促進中性粒細胞從血管內被招募到肺部，最終導致ALⅠ[11]。因此，抗巨噬細胞介導的炎癥反應可能是ALⅠ治療的有效策略。

PA是一種三萜類化合物，被廣泛報道具有抗氧化應激和抗腫瘤作用[12?13]，而PA對ALⅠ的作用卻較少被研究。在本研究中，PA抑制了巨噬細胞中p38 MAPK/MK2和Akt的磷酸化激活，而此兩者均為Toll樣受體4（toll like receptor 4,TLR4）/髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88,MyD88）信號通路的關鍵下游信號分子，通過進一步活化NF?κB（p65）促進炎癥介質和細胞因子的表達。PA對相關信號分子的抑制以及整個三萜類化合物藥理學特征提示PA可能是通過調節巨噬細胞功能發揮抗炎作用。

NO是一種炎癥標志物，用于預測炎癥的進展，是巨噬細胞在LPS暴露時在iNOS誘導下產生。本研究發現使用PA預處理抑制了原代肺巨噬細胞和小鼠巨噬細胞RAW264.7中NO的產生。活化的巨噬細胞還可以分泌大量的促炎細胞因子，如TNF?α、ⅠL?1β、ⅠL?6和ⅠL?12，這些細胞因子可以招募中性粒細胞進入肺微血管，并促進其遷移到肺實質，促進ALⅠ的發展。LPS誘導的肺損傷小鼠模型已被廣泛用于探索針對ALⅠ的治療策略。經氣管滴入肺內LPS可增加肺泡上皮通透性和炎癥細胞浸潤，進而導致炎癥細胞因子在支氣管和肺中積累，這與人類ALⅠ的病理過程非常相似。因此，本研究利用該小鼠模型研究PA對LPS誘導ALⅠ的潛在保護作用，實驗造模中觀察到滴入LPS后小鼠出現一系列ALⅠ癥狀，如呼吸及膚色改變，此外肺組織的HE染色顯示LPS組小鼠肺泡壁毛細血管充血、擴張明顯，肺泡腔和肺組織間隙滲出明顯且較多炎性細胞浸潤，與文獻報道的ALⅠ模型的病理改變一致[14]。結合上述幾點可見本例中小鼠ALⅠ模型構建成功。而給予PA預處理顯著改善了脂LPS誘導的肺組織病理改變、炎癥細胞浸潤，以及減少了肺組織中促炎細胞因子的釋放。這些結果為PA治療LPS引起的ALⅠ提供了有力的證據。

NF?κB是三萜類化合物調節炎癥性疾病中研究最多的機制之一，NF?κB作為一種重要的細胞轉錄因子，正常狀態下與ⅠκB結合，以非活性形式存在于細胞質中，在外源性配體如LPS等被TLR4識別后信號傳遞入胞內，并引起ⅠκB先后被磷酸化和泛素化，ⅠκB構象因此發生改變并被降解，解離后的NF?κB進入胞核與靶序列結合，促進靶基因的表達[15?16]。重要的是，NF?κB是LPS結合TLR4/Myd88啟動細胞內通路后p38 MAPK和Akt信號通路的關鍵靶點。p38 MAPK/MK2和PⅠ3K?Akt均可以通過調控NF?κB（p65）的磷酸化和核易位來調節LPS誘導的基因表達。本研究體內外實驗數據顯示PA抑制了LPS刺激的巨噬細胞NF?κB（p65）磷酸化。這些結果表明，PA可能通過抑制p38 MAPK/MK2和Akt介導的NF?κB的活化，導致巨噬細胞中促炎細胞因子的減少，從而抑制LPS誘導的肺損傷。

綜上所述，PA能抑制LPS誘導的巨噬細胞活化和炎癥反應，并對LPS誘導的ALⅠ小鼠肺損傷具有保護作用，其機制與抑制p38 MAPK和Akt介導的NF?κB信號通路激活相關。