肺癌組織MTA1、VEGF?C表達變化及與患者臨床病理特征、預后關(guān)系

趙麗霞，任成波，馬峰，李占林，趙峻峰

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院1.腫瘤內(nèi)科；2.放療科；3.中醫(yī)科，河北 張家口 075000）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，且受空氣污染、煙草流行、人口老齡化等因素影響，其發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢[1]。盡管隨著當前基礎(chǔ)醫(yī)學及相關(guān)學科發(fā)展，肺癌診療手段取得一定進步，但肺癌患者總體預后仍不理想，探究肺癌發(fā)生機制及與肺癌發(fā)展、預后相關(guān)的生物學標記物是臨床研究重要方向[2]。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metasta‐sis?associated gene 1，MTA1）蛋白分布于人體多種組織器官，研究認為，MTA1為脫乙酰基復合物的亞單位之一，可通過介導組蛋白去乙酰化、核小體重構(gòu)過程參與基因表達調(diào)控，可能與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF?C）與血管內(nèi)皮生長因子同源，可誘導淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移并影響其通透性，還能促進微血管形成，被認為與腫瘤淋巴管、病理性血管生成關(guān)聯(lián)密切[4]。國內(nèi)外已有研究指出[5?6]，在多種惡性腫瘤如肝癌、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌等組織中可檢出MTA1、VEGF?C過表達，二者可能與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。不過MTA1、VEGF?C在肺癌中的研究報道尚不多見，其與肺癌病理類型、預后等關(guān)系并無定論。為此，本研究通過免疫組織化學法檢測肺癌組織MTA1、VEGF?C表達情況，并分析其與患者臨床病理特征、預后關(guān)系，旨在為肺癌臨床早期診療及預后評估提供新思路。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集河北北方學院附屬第一醫(yī)院2016年1月－2018年9月經(jīng)病理確診的200例肺癌組織標本及50例癌旁正常（距腫瘤邊緣＞5 cm）組織標本。納入標準：患者均經(jīng)手術(shù)或病理活檢明確原發(fā)性肺癌診斷，且具有明確的腫瘤分期[7]；腫瘤均為單發(fā)；組織標本保存完好；年齡35~75歲；均獲取完善臨床病史及隨訪信息。排除標準：復發(fā)腫瘤病例；合并其他部位原發(fā)性腫瘤；無足夠可用于免疫組織化學分析的標本；術(shù)前已接受放化療及其他抗腫瘤治療；存在不明原因異常生化指標；失訪。200例患者中男149例，女51例；年齡41~75歲，其中＜60歲117例，≥60歲83例；病理類型：腺癌94例，鱗癌79例，小細胞癌27例；分化程度：低分化癌68例，中分化癌73例，高分化癌59例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期62例，Ⅲ期84例，Ⅳ期25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移122例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色步驟 10%（φ）中性福爾馬林溶液固定標本，石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片，烤片機烘烤（58~60℃）60 min；切片經(jīng)二甲苯脫蠟10 min，于梯度酒精脫苯處理后，以蒸餾水沖洗5 min；切片滴加3%H2O2，于室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后蒸餾水沖洗3次，再于PBS液浸泡5 min；切片置于枸櫞酸鹽緩沖液（濃度0.01 mmol/L，pH=6），高溫高壓下修復10 min，冷卻后用PBS液沖洗3次；加入封閉用正常血清工作液，室溫下封閉15~20 min，傾去，勿洗；滴加稀釋（1∶100）的一抗（羊抗人MTA1多克隆抗體、羊抗人VEGF?C多克隆抗體，均購自美國SANTA CRUZ公司），4℃孵育過夜，PBS液沖洗3次；滴加二抗工作液（生物素標記羊抗兔ⅠgG），室溫孵育15~20 min，PBS液沖洗3次；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育15~20 min，PBS液沖洗3次；以DAB顯示（顯色劑購自福州邁新公司），光鏡下控制顯色程度，行蘇木素復染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果判定 染色結(jié)果由2位工作5年以上病理科醫(yī)師獨立判斷。MTA1蛋白以細胞核著色為主，部分細胞質(zhì)著色，陽性顯色為棕黃色；VEGF?C蛋白以細胞質(zhì)著色為主，呈棕黃色顆粒。每片隨機選取5個高倍視野，每視野≥100個細胞。①染色強度：根據(jù)染色程度，棕黃色、黃色、淺黃色、無著色分別計3分、2分、1分、0分；②陽性細胞百分比：陽性細胞數(shù)＞75%、51%~75%、26%~50%、≤25%、陰性分別計4分、3分、2分、1分、0分；總積分取兩項乘積，乘積≥3分視為陽性表達。

1.2.3 隨訪 以患者治療后出院為隨訪起點，以腫瘤進展為隨訪終點，通過電話結(jié)合門診復診隨訪形式，參照實體瘤療效標準[8]，統(tǒng)計患者無進展生存期（progression free survival，PFS）（即從治療結(jié)束到腫瘤進展時間）及3年無進展生存率。隨訪時間截至2021年9月，200例患者隨訪時長5~49個月，平均（18.66±10.32）個月，中位隨訪時間16個月。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0軟件，計數(shù)數(shù)據(jù)以[n（%）]描述，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)法；繪制Kaplan?Meier生存曲線，采用Log?rank檢驗比較預后。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及癌旁組織MTA1、VEGF?C表達比較

MTA1在肺癌組織表達陽性率70.50%，顯著高于癌旁正常組織的26.00%（P＜0.05）；VEGF?C在肺癌組織表達陽性率66.00%，顯著高于癌旁正常組織的42.00%（P＜0.05）。見表1。

表1 肺癌組織及癌旁組織MTA1、VEGF?C表達比較Table 1 Comparison of MTA1 and VEGF?Cexpression in lung cancer tissues and adjacent tissues [n(%)]

2.2 不同病理類型肺癌組織MTA1、VEGF?C表達比較

不同病理類型肺癌組織中MTA1、VEGF?C表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同病理類型肺癌組織MTA1、VEGF?C表達比較Table 2 Comparison of MTA1 and VEGF?Cexpression in different pathological types of lung cancer tissues [n(%)]

2.3 MTA1、VEGF?C表達與患者臨床病理特征關(guān)系

肺癌組織MTA1陽性表達與患者腫瘤分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均為P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、脈管浸潤無關(guān)（均為P＞0.05）；VEGF?C陽性表達與患者腫瘤分化程度低、TNM分期高、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均為P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑無關(guān)（均為P＞0.05）。見表3。

表3 MTA1、VEGF?C表達與患者臨床病理特征關(guān)系Table 3 Relationship between the expression of MTA1 and VEGF?Cand clinicopathological features of patients [n(%)]

2.4 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，肺癌組織MTA1與VEGF?C表達呈正相關(guān)（P＜0.01）。見表4。

表4 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達相關(guān)性Table 4 Correlation between the expression of MTA1 and VEGF?Cin lung cancer tissues

2.5 肺癌組織MTA1、VEGF?C表達與患者預后關(guān)系

隨訪時間截至2021年9月，肺癌組織MTA1陽性表達者PFS為（16.22±8.87）月，3年無進展生存率為5.67%，均低于陰性者的（24.49±11.25）月、23.73%（Log?rankχ2=22.522，P＜0.001），見圖1；肺癌組織VEGF?C陽性表達者PFS為（16.99±9.58）月，3年無進展生存率為7.09%，均低于陰性者的（21.90±11.00）月、20.34%（Log?rankχ2=7.762，P=0.005），見圖2。

圖1 肺癌組織MTA1陽性表達與陰性表達的生存曲線Figure 1 Survival curve of positive and negative expression of MTA1 in lung cancer tissues

圖2 肺癌組織VEGF?C陽性表達與陰性表達的生存曲線Figure 2 Survival curve of positive and negative expression of VEGF?Cin lung cancer tissues

3 討論

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因之一，而惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移本身是一個極其復雜、高度選擇的非隨機過程，可受多基因、多分子調(diào)控，探究相關(guān)分子生物學機制是提高肺癌診斷及預防的重要前提[9]。一方面，細胞黏度、細胞外基質(zhì)降解、病理性血管生成等過程是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要生物學基礎(chǔ)，另一方面，癌細胞的增殖、凋亡直接影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此圍繞相關(guān)過程探究敏感的生物標記物是肺癌研究的重要方向之一[10]。

MTA1是MTA家族重要成員，該家族能同組蛋白脫乙酰基酶1、組蛋白脫乙酰基酶2相互結(jié)合，參與核小體形成組蛋白去乙酰化復合物重塑，與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[11]。MTA1基因定位于人染色體14q32.3，編碼的MTA1蛋白羧基末端富含脯氨酸，其695~705殘基序列同SH3結(jié)構(gòu)域完全配對，而后者可參與信號傳導通路中蛋白與蛋白間相互作用，與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞運動、增殖等多種過程有關(guān)[12]。MTA1蛋白還具有2個酪氨酸激酶、7個酪蛋白激酶Ⅱ、9個蛋白激酶的磷酸化位點以及4個N?糖激化位點，可與信號傳導通路中維持細胞正常功能的蛋白發(fā)生作用[13]。此外，MTA1蛋白自251殘基起有一個亮氨酸反折區(qū)、5個SPXX域，自393殘基始 有 一個鋅指DNA結(jié) 合域Cys?X2?Cys，與DNA結(jié)合蛋白、基因調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)；還有一個SANT結(jié)構(gòu)域，同轉(zhuǎn)錄因子myb?相關(guān)蛋白的DNA結(jié)合域相似，可能參與細胞存活、增殖、分化等調(diào)節(jié)[14]。MTA1基因首次于老鼠的乳腺癌細胞株分離所得，其表達與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而近些年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，MTA1蛋白高表達還與人類多種腫瘤如喉部鱗狀細胞癌、鼻咽癌等侵襲力有關(guān)[15?16]。國內(nèi)有學者發(fā)現(xiàn)，抑制MTA1的表達，能抑制人食管癌Eca109細胞增殖，誘導細胞凋亡[17]。此外，MTA1表達并不局限于腫瘤，在正常組織器官如腦、肝、睪丸等中也可檢測出MTA1不同程度表達，其與各種癌腫的相關(guān)性報道也不盡相同[18]。本研究采用免疫組化法對肺癌組織中MTA1進行定性檢測，發(fā)現(xiàn)MTA1在細胞核、細胞質(zhì)中均可表達，這可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展中MTA1表達及定位紊亂有關(guān)。本文結(jié)果顯示，肺癌組織MTA1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與不同病理類型無關(guān)，但與分化程度低、TNM分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MTA1可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展。

血管與淋巴管生成既是組織生長、傷口愈合的重要生理過程，也是包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，其中血管內(nèi)皮生長因子家族是血管生成主要的調(diào)控系統(tǒng)，也是參與淋巴管形成的重要因子[19]。VEGF?C作為血管內(nèi)皮生長因子家族重要成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促淋巴管生長因子，一方面VEGF?C可通過與VEGFR?3結(jié)合，誘導淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，同時增加淋巴管通透性，與腫瘤淋巴管形成、癌細胞淋巴血管轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)密切；另一方面VEGF?C還可通過與VEGFR?2結(jié)合，參與生理性或病理性血管生成過程啟動，與腫瘤血管生成有關(guān)。此外，VEGF?C在癌細胞脫離基質(zhì)、到達轉(zhuǎn)移部位時抑制其凋亡，可促進腫瘤生長，因此被認為在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的不同階段均有重要作用[20?21]。在已研究的人類腫瘤中，有一半腫瘤細胞如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等均可表達VEGF?C[22]。殷文娟等[23]研究指出，VEGF?C在喉鱗狀細胞癌中呈高表達，且與腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本文結(jié)果顯示，肺癌組織VEGF?C陽性表達率較癌旁正常組織高，與不同病理類型無關(guān)，與分化程度低、TNM分期高、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示VEGF?C可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展。本文結(jié)果還顯示，肺癌組織MTA1與VEGF?C表達呈正相關(guān)，提示二者可能在肺癌發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用。有研究[24]指出，VEGF?C表達可受多個通路影響，其中包括MTA1的調(diào)控，其傳導通路為缺氧誘導因子?1α。此外，本文結(jié)果顯示，肺癌組織MTA1、VEGF?C陽性表達者PFS縮短、3年無進展生存率下降，說明MTA1、VEGF?C陽性表達與患者預后有關(guān)，二者在肺癌預后判斷中展現(xiàn)出一定應用價值，同時提示在臨床實踐中，對MTA1、VEGF?C陽性表達或許可通過相關(guān)靶向治療，提高抗腫瘤效果。

綜上所述，肺癌組織MTA1、VEGF?C呈異常高表達，可能與肺癌發(fā)展及預后有關(guān)，在肺癌預后評估及相關(guān)靶向治療中展現(xiàn)出一定應用前景。本研究不足之處在于缺乏MTA1、VEGF?C在肺癌作用中具體機制探究，且未對MTA1、VEGF?C表達進行定量檢測，可能結(jié)果不夠精準，因此尚需其他研究佐證，這也是筆者后期研究關(guān)注的方向。