脂聯素對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用及其機制

劉魯倩，陳 玲，秦敘青,3，何文君，楊 瑞,3，單莉婭,3，李新芝，馬克濤,3

膿毒癥是危害人類健康的一大疾病，盡管抗感染的水平有了很大的提高，但是膿毒癥病死率依然居高不下[1-2]。其中，膿毒癥心肌損傷是膿毒癥及多器官功能衰竭的重要表現，其發病率較高，預后較差，涉及多種信號分子機制，如細胞凋亡、鈣離子轉運障礙等。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種內毒素，由革蘭陰性細菌產生，可以引起炎癥和心肌細胞凋亡。因此，抑制LPS引起的心肌損傷可能會成為膿毒癥治療的突破口。脂聯素(adiponectin，APN)是一種細胞因子，由脂肪細胞合成和分泌，大約占血漿總蛋白的0.01%[3]。APN具有抗炎，抗動脈粥樣硬化的作用[4]，對心腦血管疾病的發生發展亦起著調控作用[5]。但是APN對LPS誘導的小鼠膿毒癥心肌損傷的保護作用以及可能的機制，目前尚不明確。該研究旨在通過LPS誘導小鼠膿毒癥心肌損傷，探討APN是否有保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型制備選取體質量控制在(25±5)g的健康雄性C57BL/6J小鼠30只，該小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0006。將所有的C57BL/6J小鼠置于石河子大學動物實驗飼養中心，并按照石河子大學動物實驗倫理委員會的要求進行整個實驗。所有小鼠在適宜溫度下飼養，濕度和光線良好。所有的小鼠適應性喂養1周后，將30只小鼠隨機分為3組，10只/組，分為假手術組(sham組)、膿毒癥心肌損傷組(LPS組)、脂聯素干預組(LPS+APN組)。參考前期文獻[6]的方法每只小鼠腹腔注射10 mg/kg的革蘭陰性細菌LPS以制備膿毒癥心肌損傷模型，同時sham組予以等量的0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射，LPS+APN組于注射LPS前12 h給予腹腔注射6 mg/kg[7]的脂聯素，12 h后小鼠處死，并進行實驗檢測。

1.2 主要試劑APN(美國PeproTech公司)；脂多糖(美國sigma公司)；凋亡相關蛋白如兔抗Bax抗體(貨號ab199677)、兔抗Bcl2抗體(貨號ab196495)、兔抗Caspase3抗體(貨號ab13847)以及兔抗連接蛋白43(Cx43)抗體(貨號ab11370)均購于美國Abcam公司；小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG均購于北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1心肌HE染色 將每組心肌組織置于10%甲醛中過夜，然后脫水并包埋在石蠟中。將所有心肌組織切成5 μm厚的切片，固定在載玻片上并烘烤干燥，然后染色。根據使用說明書，將切片分別浸入二甲苯、濃度梯度的乙醇和蘇木精中，并用中性樹膠密封。使用光學顯微鏡觀察心肌細胞、心臟基質和肌絲的形態。

1.3.2Western blot法檢測各組凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2以及Cx43的表達 各組造模結束后，迅速取出小鼠心肌組織，用研磨機將心肌組織打碎，加入裂解液在冰上裂解至少20 min，每隔10 min搖勻一下，4 ℃離心組織并用BCA法測蛋白濃度并配平，待蛋白冷卻后分裝儲存。用SDS-PAGE分離，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上電轉，電轉結束后，用TBST洗去多余的電轉液，并用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，封閉結束后，加入以下抗體4 ℃過夜：兔抗Bax抗體(1 ∶1 000)、兔抗Bcl-2抗體(1 ∶1 000)、兔抗Caspase3抗體(1 ∶1 000)、兔抗Cx43抗體(1 ∶1 000)、小鼠抗β-actin抗體(1 ∶1 000)和小鼠抗GAPDH抗體(1 ∶1 000)。次日，用TBST洗膜3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，用TBST洗去二抗，于暗室中滴加發光試劑，壓片、顯影、定影，使用Quantity One軟件(Bio-Rad公司)獲取圖像并分析。

1.3.3免疫組織化學染色 將心肌組織切片在60 ℃的烤箱中烘烤2 h，分別用二甲苯脫蠟3次，5 min/次，100%、90%、80%、70%乙醇脫水，5 min/次，自來水沖洗干凈，枸櫞酸鈉修復并用3%的過氧化氫抑制內源性過氧化酶活性，用山羊血清37 ℃封閉1 h，隨后，加入相應的一抗(Bax，1 ∶100；Bcl-2，1 ∶100；Caspase3，1 ∶100；Cx43，1 ∶100)4 ℃過夜，次日，洗凈一抗后加入二抗，37 ℃孵育1 h，加入DAB顯色，待標本抗體標記的陽性部位顯色后，立即用自來水沖洗掉，接著，用蘇木精復染3 min，自來水洗3次，1%鹽酸酒精分化6～7 s，自來水沖洗3次，然后自來水藍化3 min，并在70%、80%、90%、100%乙醇脫水，烘干后中性樹膠封片。隨機選擇6個樣本/組，并在每個樣本中隨機選擇5個視野，然后在光學顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 各組心肌組織病理學觀察sham組心肌纖維排列整齊且胞質豐富均勻，細胞間隙正常，邊界清晰，無病理變化；LPS組可見多數炎性細胞浸潤，且伴有心肌細胞壞死情況；LPS+APN組心肌細胞壞死情況改善，心肌纖維數量增多，心肌損傷情況降低，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織的HE ×400A：sham組；B：LPS組；C：LPS+APN組

2.2 各組凋亡蛋白指標Caspase3、Bcl-2、Bax表達通過Western blot檢測sham、LPS、LPS+APN組各指標蛋白相對表達量。與sham組比，LPS組促凋亡蛋白cleaved caspase3、Bax表達增高，然而抗凋亡蛋白Bcl-2表達低于sham組,LPS+APN組cleaved caspase3、Bax蛋白表達低于LPS組,Bcl-2蛋白表達高于LPS組(P<0.05)。同時進行免疫組織化學染色檢測各組心肌組織Caspase、Bcl-2、Bax蛋白表達，Caspase3及Bax的表達情況：sham組中偶見棕黃色顆粒，LPS組的表達明顯高于sham組，LPS+APN中棕黃色顆粒明顯降低。Bcl-2的表達情況：

sham組中可見棕黃色顆粒表達，LPS組的表達明顯低于sham組，LPS+APN中棕黃色顆粒表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 Western blot法檢測各組小鼠心肌組織中凋亡蛋白A：Western blot法檢測心肌組織內凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達；B：心肌組織內凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白水平的半定量分析；C：心肌組織內凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平的半定量分析；D: 心肌組織內凋亡蛋白Bax蛋白水平的半定量分析；1：sham組；2：LPS組；3：LPS+APN組；與sham組比較：**P<0.01；與 LPS組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖3 免疫組織化學染色檢測心肌組織中Caspase3、 Bax、Bcl2蛋白表達 ×400A：心肌組織內凋亡蛋白Caspase3蛋白表達；B：心肌組織內凋亡蛋白Bax蛋白表達；C: 心肌組織內凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達；1：sham組；2：LPS組；3：LPS+APN組

2.3 各組Cx43的表達通過Western blot檢測sham組、LPS組、LPS+APN組Cx43相對表達量。與sham組比較，LPS組Cx43的表達增高，然而LPS+APN組Cx43的表達低于LPS組(P<0.05)。免疫組織化學染色檢測各組心肌組織中Cx43的表達：sham組中可見棕黃色顆粒，LPS組的表達高于sham組，LPS+APN中棕黃色顆粒明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 Western blot法檢測各組小鼠心肌組織中Cx43 A：Western blot法檢測心肌組織Cx43的表達；B：心肌組織內Cx43水平的半定量分析；1：sham組；2：LPS組；3：LPS+APN組；與sham組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

圖5 免疫組織化學染色檢測心肌組織中Cx43的表達 ×400A：sham組；B：LPS組；C：LPS+APN組

3 討論

臨床上，膿毒癥具有起病快、發病急、病死率高等特點，發生膿毒癥時，炎癥、氧化應激、線粒體損傷、微循環障礙、免疫紊亂、自噬損傷、凋亡等病理機制使全身各種組織和器官損傷，最終導致多器官功能衰竭。其中，膿毒癥心肌損傷是膿毒癥多器官功能衰竭的一個重要環節，越來越多的研究[8]表明，因膿毒癥感染性休克的患者多表現為心功能不全。因此，保護心臟功能是治療膿毒癥的一個重要環節。目前已經有研究[9]報道腹腔注射脂多糖可以誘發膿毒癥且導致心臟損傷，該研究使用LPS誘導膿毒癥心肌損傷,與前期的研究結果一致，實驗顯示，注射LPS可使小鼠誘發膿毒癥，且會發生膿毒癥心肌損傷,具體表現為心肌組織有多數炎性細胞浸潤，且伴有心肌細胞壞死情況。APN具有多種作用，如抗炎、抗凋亡和抗動脈粥樣硬化。既往的研究[10]表明APN有心臟保護作用。該研究提示，APN可保護LPS所致的膿毒癥心肌損傷，APN預處理后，心肌組織中炎性細胞浸潤及心肌細胞壞死情況明顯緩解，心肌纖維數量增多，心肌損傷獲得改善。

許多調節因子在膿毒癥心肌損傷的發病機制中起著至關重要的作用[11]。細胞凋亡已被證明是心臟功能下降的主要原因之一[12]。有研究[13]表明膿毒癥休克大鼠心肌細胞會發生凋亡，并證實凋亡在膿毒癥誘導的兒童心肌抑制中起著更重要的作用。本研究中，也出現了類似的結果，與假手術組相比，膿毒癥心肌損傷組凋亡蛋白Caspase3、Bax表達水平明顯增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，使用脂聯素干預后，膿毒癥心肌損傷的凋亡蛋白指標明顯改變，與膿毒癥心肌損傷組相比，凋亡蛋白Caspase3、Bax表達水平明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增高。實驗表明，APN可以通過調節細胞凋亡來保護膿毒癥心肌損傷 。

縫隙連接是一種膜通道結構，介導細胞間的通訊，存在于兩個細胞之間，具有重要的生物學功能。Cx43是最主要的縫隙連接蛋白，尤其在心室肌中，對于電傳導發揮著不可或缺的作用。有學者發現在肥厚型心肌病、心力衰竭、缺血性心肌病等多種心臟病中，Cx43的分布和表達均發生改變[14]。Cx43在細胞生長、增殖和凋亡中起重要作用。林俊敏 等[15]研究證明，在心力衰竭大鼠心臟中Cx43表達明顯增加，且分布紊亂。該實驗顯示，與假手術組相比，膿毒癥心肌損傷組Cx43的蛋白表達明顯增高，使用APN預處理后，Cx43的水平有所降低，提示APN可能通過調節Cx43的表達來保護膿毒癥心肌損傷。

綜上所述，該研究表明，APN可有效地保護膿毒癥心肌損傷，其機制可能是調節細胞凋亡途徑以及Cx43的表達。因此，APN為臨床上治療膿毒癥心肌損傷成為了一種新的可能。