連翹精油- ε-pL-Nisin復合涂膜保鮮液配制

高 倩，張曉虎，郭元園

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

0 引言

連翹為木犀科連翹屬植株，不僅具有清熱解毒、降火消腫、利尿、保護心血管、抗癌等藥理作用，而且具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[1～4]。研究表明，連翹可作為雙黃連口服液、連花清瘟顆粒、維C銀翹片等藥劑的重要原料組成成分，也可應用于醫療保健、食品保鮮、化妝品等領域[5]。連翹精油是一種具有特殊芳香氣味、分子量較小的有機代謝化合物，廣泛存在于連翹植株的花、葉和果實中，尤其在果實中的含量高達4%[6,7]，主要抑菌有效成分由單萜、倍半萜烯、丙酮、醛、酚、醇等組成。連翹精油呈棕黃色液體，在常溫下易揮發，具有顯著的抑菌、抗菌、抗氧化、抑制微生物生長繁殖、抗病毒等生物活性[8,9]。

番茄又稱為西紅柿，屬于茄科屬植物，其作為一種呼吸躍變果實，含有豐富的番茄紅素、維生素C、類胡蘿卜素等多種營養物質，但是由于水分含量較高、果皮薄，因此其易受微生物的影響，抗病力弱、易軟腐，導致番茄不耐儲存，保鮮效果差，鎖水時間短[10]。

目前，食品安全問題受到廣泛關注，食品保鮮防腐劑的天然化已成為一種不可逆轉的發展趨勢，安全、天然、高效的食品才會備受青睞。復配型天然保鮮劑不僅高效、穩定性好，而且高度安全、價格適中。研究表明不同性能的抗菌劑的適量配合制成的防腐劑具有增效和協同作用，可以克服單一防腐劑的不足[11,12]。根據殼聚糖[13～15]、ε-聚賴氨酸[16～18]和Nisin[19,20]的抑菌作用機理及作用于微生物的方式不同，將三者與連翹精油進行復配，可達到增效協同的作用且有效擴大抑菌譜，節約生產成本。

筆者以連翹精油為原料，輔以殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin制備復合保鮮涂膜液，采用響應面法優化配方，對番茄進行保鮮實驗研究，以期有效延長番茄的保鮮期，為連翹精油保鮮涂膜液在果蔬貯藏保鮮提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 連翹果實(2019年9月采于商州區金鳳山)；當日產新鮮番茄(購于商州區菜市場)。

1.1.2 試劑 CO2(食品級，純度在 99%以上，購于成都市緣和基業化工有限責任公司)；95%乙醇(分析純)；蒸餾水；次氯酸；殼聚糖(食品級)；ε-聚賴氨酸(食品級)； Nisin(食品級)；冰乙酸(分析純)。

1.1.3 供試菌種 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(商洛學院微生物實驗室提供)。

1.1.4 儀器設備 見表1。

表1 實驗主要儀器設備

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 將連翹果實清洗干凈、放置通風處干燥后，于60℃電熱恒溫干燥箱烘干，高速萬能粉碎機粉碎，過60目篩，取若干份(每份10 g)，分裝后用紗布包裹，密封備用。

1.2.2 連翹精油的萃取 采用超臨界CO2流體萃取連翹果實中的精油[21]。

1.2.3 連翹精油的抑菌試驗 將蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，加入15%氫氧化鈉溶液大約2 mL，調節pH至7.2～7.4。加入瓊脂20 g繼續加熱煮沸，待瓊脂融化后分裝試管中，每管2～3 mL，經121℃高壓滅菌20 min。參考文獻制備菌懸液[22]，采用濾紙片法測連翹精油抑菌環直徑[23]。

1.2.4 涂膜液的制備 分別稱取適量的連翹精油、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin溶于蒸餾水中配制不同濃度梯度的保鮮涂膜液，將番茄浸泡于保鮮液中處理3 min后取出，晾干；對照組放在蒸餾水中浸泡3 min，撈出晾干，分別置于一次性消毒保鮮盒中，在25℃、相對濕度65%的條件下貯藏10 d，每隔2 d取樣一次，測定番茄的失重率和維生素C含量，每組重復三次，結果取平均值。

1.2.5 番茄的選擇與處理 選擇大小均一 、色澤及成熟程度一致、無機械損傷和害蟲侵染的番茄果實，用清水充分沖洗果實表面，用濃度為2%的次氯酸溶液進行清洗消毒，最后用緩水流沖洗2 min，放置在通風處晾干，分組備用。

1.2.6 單因素試驗設計 分別配置連翹精油濃度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、殼聚糖溶液濃度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、ε-聚賴氨酸濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%)、Nisin濃度(0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%)的涂膜保鮮液，按照1.2.4中的方法處理番茄。

1.2.7 番茄新鮮度指標測定 主要有:

(1)失重率采用稱重法計算[24]。

失重率(%) =(儲藏前的稱重-儲藏前后的重量)/儲藏前的重量×100%

(2)Vc含量采用2,4-二硝基苯肼比色法測定[25,26]。

1.2.8 響應面實驗設計 在單因素試驗基礎上，選擇3個影響顯著的因素，依據中心組合試驗設計原理，設計3因素3水平的響應面分析實驗，以失重率和VC含量作為響應值，實驗所得數據采用Design-Expert 8.06軟件進行作圖和分析，確定保鮮涂膜液的最佳復合配方。

2 結果與分析

2.1 連翹精油抑菌實驗

表2 不同濃度連翹精油抑菌效果

由表2可知，抑菌圈的直徑愈大，其抑菌效果愈好。連翹精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌抑菌效果更顯著，即對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于革蘭氏陰性菌，并且抑菌效果均隨著連翹精油組分濃度的增加，抑菌活性亦增強。

2.2 單因素實驗結果與分析

由圖1～圖4可知，分別用不同濃度連翹精油、殼聚糖、ε-聚賴氨酸、Nisin處理番茄，隨著貯藏時間的增加，其失重率呈逐漸上升趨勢，維生素C含量呈緩慢下降趨勢，各處理組番茄的失重率均低于對照組，維生素C含量均高于對照組；0.5%濃度的連翹精油，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；0.1%濃度的ε-聚賴氨酸，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；1%、1.5%、2.5%濃度的殼聚糖，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不太大；0.01%濃度的Nisin，隨著儲藏時間的延長對番茄失重率和維生素C含量變化的差異不大。綜合考慮，最終固定殼聚糖濃度為2%，選取濃度連翹精油濃度1%～2%；ε-聚賴氨酸濃度0.3%～0.7%；Nisin濃度0.03%～0.07%。

圖1 不同濃度連翹精油對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖2 不同濃度ε-聚賴氨酸對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖3 不同濃度殼聚糖對番茄失重率和維生素C含量的影響

圖4 不同濃度Nisin對番茄失重率和維生素C的影響

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 響應面實驗方案與結果 綜合考慮單因素實驗結果分析，固定殼聚糖的濃度為2%，以連翹精油濃度(A)、ε-聚賴氨酸濃度(B)和Nisin濃度(C)為自變量，以失重率和Vc含量作為響應值(Y)。采用Design-Expert 8.06軟件，設計3因素3水平的響應面分析共17組實驗，中心組合試驗設計方案及其結果見表3。

表3 中心組合試驗設計水平方案及結果

2.3.2 回歸分析 根據響應面數據進行回歸分析，擬合獲得失重率(Y1)和維生素C含量(Y2)的回歸方程如下：

Y1=0.75+0.04A-0.021B-0.094C+0.077AB-0.088AC+0.13BC+0.035A2+0.21B2+0.19C2

Y2=0.42+0.011A+0.021B-0.030C+1.750E-003AB+0.049AC-2.750E-003BC-0.088A2-0.016B2-0.071C2

依據響應面數據進行回歸分析，失重率(Y1)和維生素C含量(Y2)回歸模型的系數顯著性數據分析見表4、表5；回歸模型方差分析結果見表6、表7。

表4 失重率回歸模型的系數顯著性數據分析結果

表5 Vc含量回歸模型的系數顯著性數據分析結果

表6 失重率回歸模型方差分析結果

表7 Vc含量回歸模型方差分析結果

依據表4和表5可知，回歸方差分析表，此回歸模型p<0.01說明方差模型顯著，失擬項p=0.051 7和p=0.068 3>0.05，說明失擬項不顯著，此方程模擬的3因素3水平實驗分析是可行的。由表6、表7可知，失重率回歸模型相關系數R12=0.994 3，維生素C含量回歸模型相關系數R22=0.999 8，說明該模型的擬合程度表現為良好，且實驗的誤差較小，所以可用此模型來篩選出番茄保鮮效果最好的連翹精油天然復合保鮮涂膜液配方。

從表4可知，A(連翹精油)和B(ε-聚賴氨酸)的p<0.05，C(Nisin)的p<0.01，說明連翹精油和ε-聚賴氨酸對番茄貯藏期間失重率均是顯著，Nisin對番茄貯藏期間失重率是顯著；AC項、BC項對番茄失重率的影響為顯著(p<0.01)，二次項(B2、C2)對番茄的失重率影響為顯著。從表5可知，A(連翹精油)、B(ε-聚賴氨酸)和C(Nisin)的p<0.01，說明連翹精油、ε-聚賴氨酸和Nisin對番茄貯藏期間維生素C含量均是極顯著，二次項(A2、B2、C2)對番茄維生素C含量影響均為顯著，這表明各因素對響應值(Y)的影響不是簡單的線性關系。

2.4 響應面交互因素分析

2.4.1 ε-聚賴氨酸番茄貯藏期間各交互因素對失重率的影響 由圖5～圖7可知，等高線呈現出橢圓形狀，說明兩個因素之間存在顯著交互作用，且響應面的曲面較陡峭，表明因素間交互作用影響顯著。響應面圖5結果顯示B軸方向的坡度較A 軸較陡，表明ε-聚賴氨酸對番茄失重率的影響程度比連翹精油較大。響應面圖6結果顯示C軸方向的坡度較A 軸較陡，表明Nisin對番茄失重率的影響程度比連翹精油較大。最終各因素極值濃度為：ε-聚賴氨酸在0.44%～0.66%左右；連翹精油在1.0%～1.83%左右；Nisin的極值濃度在0.43%～0.58%左右。

圖5 連翹精油與ε-聚賴氨酸交互作用對番茄失重率的等高線和響應面

圖6 連翹精油與Nisin交互作用對番茄失重率的等高線和響應面

圖7 ε-聚賴氨酸與Nisin交互作用對番茄失重率的等高線和響應面

2.4.2 番茄貯藏期間各交互因素對維生素C含量的影響 由圖8～圖10可知，等高線呈現出橢圓形狀，說明兩個因素之間存在顯著交互作用，且響應面的曲面較陡峭，表明因素間交互作用影響顯著。響應面圖8結果顯示B軸方向的坡度較A 軸較緩，表明連翹精油對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比ε-聚賴氨酸較大。響應面圖9結果顯示A軸方向的坡度較C軸較陡，表明連翹精油對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比Nisin較大。響應面圖10結果顯示B軸方向的坡度比C軸較緩，表明Nisin對番茄貯藏期間維生素C含量的影響程度比ε-聚賴氨酸較大。最終各因素對番茄貯藏期間維生素C含量極值濃度范圍：ε-聚賴氨酸在0.48%～0.70%左右；連翹精油在1.41%～1.68%左右；Nisin的極值濃度在0.31%～0.62%左右。

圖8 連翹精油與ε-聚賴氨酸交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應

圖9 連翹精油與Nisin交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應面

圖10 ε-聚賴氨酸與Nisin交互作用對番茄維生素C含量的等高線和響應

2.5 驗證性結果分析

響應面優化得到的連翹精油涂膜液復合配方為：連翹精油1.46%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.52%、Nisin0.05%，在此條件下，番茄儲藏期間失重率為0.7492%，維生素C含量為0.4189 mg/g。結合實際情況調整最優復合涂膜液配方為：連翹精油1.50%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.50%、Nisin0.05%，在該條件下，番茄儲藏期間失重率為0.75%，維生素C含量為0.42 mg/g。試驗失重率較低，維生素C含量較高，與模型理論預測值相差甚小，表明能把該響應面優化配方應用于番茄保鮮。

3 結論與討論

3.1 結論

(1)連翹精油對金黃色葡萄球菌抑菌效果比大腸桿菌更為顯著，且抑菌效果均隨著其組分濃度的增加，抑菌活性呈現上升趨勢。

(2)單因素實驗中對番茄儲藏期間的失重率、維生素C含量變化的趨勢分析表明：對番茄影響最重要的三個因素為連翹精油、ε-聚賴氨酸和Nisin。

(3)響應面配方優化實驗得出復合涂膜保鮮液的最佳配比為：連翹精油1.50%、殼聚糖2.0%、ε-聚賴氨酸0.50%、Nisin0.05%；在25℃、相對濕度65%的條件下，番茄儲藏10 d，失重率為0.75%，維生素C含量為0.42 mg/g。

3.2 討論

(1)研究采用超臨界流體CO2技術提取的連翹精油，其提取率與何勇[21]優化連翹精油提取實驗得出數據相吻合。

(2)研究制備的復配型生物涂膜保鮮液在果蔬的應用上更加安全穩定，一定程度上彌補了使用單一防腐劑抑菌保鮮效果的缺陷。

(3)筆者研究不足之處是連翹精油具有一定的揮發性，長期貯藏未密封包裝的食品，保鮮效果會下降，建議與低溫貯藏相結合效果較佳。

(4)研究未對復合保鮮膜的機理進行探討，也未對保鮮涂膜的性能進行測評。在以后研究中，應當進行相關研究，以期為連翹精油-ε-pL-Nisin復合涂膜保鮮液實際應用于食品防腐保鮮提供技術支持。