熒光定量PCR檢測女性HPV-DNA的臨床價值

姜趙華 肖勇武

736200甘肅省敦煌市醫院，甘肅敦煌

宮頸癌為女性常見、多發惡性腫瘤，也是致女性死亡的主要疾病。尤其是近年來，宮頸癌在臨床發病特點上又出現了一些新的變化，表現為患病者年齡呈年輕化、發病率不斷增高[1]。因宮頸癌有較長的可逆性癌前病變期，因此，早發現、早治療可以在很大程度上延長其存活時間，這也是臨床重視并強調宮頸癌篩查與預防的出發點，通過有效篩查、降低宮頸癌發病率和致死率。人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種DNA腫瘤病毒，HPV感染是造成皮膚、黏膜良性或惡性病變的主要因素，很多腫瘤均與HPV 感染相關[2]。隨著臨床對宮頸癌研究的深入，發現HPV 感染與宮頸腫瘤之間也有密切關聯。對HPV 的檢測，以往臨床采用血清學檢測方法、巴氏涂片、體外病毒培養基液基薄層細胞技術等方法，在一定程度上有操作復雜、主觀性較大的缺點，使結果缺乏準確度，給HPV 臨床診斷和治療造成一定影響。實時熒光定量PCR 方法可以直接測定HPV 的DNA，能夠靈敏、快速地檢出HPV的存在，是檢測HPV的理想方法[3]。本研究采用熒光定量PCR 技術對女性宮頸分泌物標本感染HPV的情況進行研究，評價該技術的臨床應用價值，以期為大規模展開女性HPV-DNA篩查、預防宮頸癌發生提供參考。

資料與方法

搜集2016年10月-2021年5月敦煌市醫院來自體檢中心26 630 例、門診12 521 例、住院患者5 576 例研究對象的宮頸分泌物，總計44 727 例；年齡18～57歲，平均年齡(37.5±19.5)歲。

方法：⑴儀器和試劑：全自動醫用PCR 分析儀(SLAN-96P)；檢測試劑盒由圣湘生物科技股份有限公司提供。⑵標本采集：采集標本時，先用窺陰器/陰道張開器輔助宮頸暴露，用棉拭子把宮頸口位置過多的分泌物擦掉，宮頸刷放在宮頸口的位置，單方向轉5圈，再把宮頸刷頭部放入洗脫管，沿刷柄折痕位置折斷宮頸刷柄，之后將洗脫管蓋旋緊，送檢。不能馬上送檢時，應放置在-20℃的環境下保存，并于7 d內完成檢測。⑶檢測方法：采用PCR 熒光探針法檢測：①DNA提取：洗脫宮頸刷，將洗脫液放入1.5 mL離心管，13 000 r/min，離心10 min，棄上清液，取50 mL裂解液加入其中懸浮、沉淀，使用沸水浴的方法加熱10 min后，13 000 r/min，離心10 min，取上清液備用。②PCR擴增：嚴格按照說明書要求設置擴增參數，取20 μL反應液加到5 μL已經提取的待測樣本DNA 中，進行雜交與顯色。③結果判讀：結合膜條上藍色斑點顯現位置，對相應位置標記的基因型信息進行讀取，只有1個基因型位點有藍色斑點，表示相應基因型單一感染，多個基因型位點有藍色斑點，表示相應基因型的混合感染；陰性質控品雜交膜條除了在IC 位點有藍色斑點，其他部位均無顯色，陽性質控品必須保證在相應HPV 基因型位點和IC 位點有顯色。⑷宮頸病變診斷：采用熒光定量PCR 技術檢測宮頸分泌物中HPV 的起始病毒量，認為PCR 結果拷貝數高于最低檢測值，即50拷貝/mL者，為可疑陽性標本[4]。根據檢測基因型將致病性分為高危型、低危型，高危型如HPV16、18、31、33、35 等，低危型如HPV6、11、42、43等。⑸宮頸病理活檢：對檢測到上皮內病變的患者進行病理學檢查，用活檢鉗取幾小塊組織，放于10%甲醛溶液中固定，送至病理科做切片，染色后于顯微鏡下觀察、分析，得到病理診斷。①炎性與良性病變，如宮頸炎、宮頸肥大、息肉等；②宮頸上皮內瘤變(CIN)，有CIN Ⅰ(輕度)、CINⅡ(中度)、CIN Ⅲ(重度)；③浸潤性宮頸癌。

觀察指標：①比較門診、住院患者與健康體檢者HPV 感染率；②統計熒光定量PCR 法對高危HPV 的檢出率；③比較熒光定量PCR 法檢測高危型HPV 結果與病理活檢的符合率。

統計學處理：數據應用SPSS 25.0 軟件處理；計數資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

門診、住院患者與健康體檢者HPV 感染率比較：門診12 521 例患者中，檢測HPV 感染3 005例(24.00%)，其中多重感染876 例(7.00%)；住院患者5 576例中，檢測HPV感染1 394例(25.00%)，其中多重感染390 例(6.99%)；體檢中心26 630 例健康者中，檢測HPV 感染3 461 例(13.00%)，其中多重感染798例(3.00%)。門診與住院患者HPV 感染率高于健康體檢者，差異有統計學意義(P＜0.05)。

熒光定量PCR法檢測高危HPV：44 727例研究對象中，熒光定量PCR法檢出HPV感染7 860例，陽性率為17.57%；其中高危型2 542 例(32.34%)、低危型5 318例(67.66%)。

熒光定量PCR法檢測高危型HPV 結果與病理活檢的符合率：熒光定量PCR 法檢測高危型HPV 陽性符合率為93.30%(362/388)，陰性符合率為93.59%(2 016/2 154)，總符合率為93.55%(2 378/2 542)。見表1。

表1 熒光定量PCR法檢測高危型HPV結果與病理活檢的符合率

討論

目前已經發現的HPV 亞型有百種之多，其中40多種常見HPV 會造成女性生殖道感染，且高危型HPV的持續感染更是增加了宮頸癌發生的概率[5]。近年來，宮頸癌在全球的發生率均有所增加，是威脅廣大女性生命安全的主要惡性腫瘤，對于本病的預防及治療越來越重要，及早發現、及早預防和治療對宮頸癌預后改善有重要作用。HPV 感染作為宮頸癌發生的重要誘因，HPV 檢測已經被臨床認為是預防腫瘤發生、控制腫瘤發展的重要方法。目前在很多醫院的婦產科已經設立了高危型HPV 檢查，對女性宮頸組織行HPV-DNA 檢測可有效且及時地監控宮頸癌與癌前病變的發生、發展。通過采用熒光定量PCR 檢測HPV-DNA，不僅簡單、易掌握，而且成本較低，醫務工作者經過一段時間的學習和培訓便可實踐應用，普及性強。因此，采用熒光定量PCR檢測HPV-DNA已經成為很多地區篩查宮頸癌的主要手段。

HPV 感染之后使用傳統的病毒培養方法與血清學檢測難以及早發現，特別是女性性接觸傳播疾病患者的生殖道混合感染、宮頸糜爛等存在著HPV 潛伏性感染。對于沒有直觀皮損或者是亞臨床感染者，HPV 能夠通過寄生在受損宮頸上皮，使宮頸發生持續感染，再歷經8～10年的時間，宮頸上皮便會發生不典型增生，導致發生程度各異的癌前病變，最終致癌變發生。隨著醫學實驗技術的發展，HPV 感染檢查方法有了很大進步，其中熒光定量PCR 技術是目前最常用也是非常靈敏的檢測方法，該技術簡單易行，將普通PCR 的高靈敏性、DNA 雜交的高特異性以及光譜技術的高準確性有機結合，突出特異性強、靈敏度好、定量準確、速度快以及重復性好等諸多優點。較細胞學檢查，采用PCR檢測HPV-DNA的敏感度更高，其原因可能與信號放大作用有關。本研究中，采用PCR 熒光探針定量檢測，從搜集到的體檢中心26 630 例，門診12 521 例，住院患者5 576 例，總計44 727 人中，檢測HPV 陽性率為17.57%。通過對檢測到上皮內病變的患者進行病理學檢查，比較發現熒光定量PCR 法檢測高危型HPV 陽性符合率為93.30%，陰性符合率為93.59%，總符合率為93.55%，檢出率均較高。熒光探針PCR 法能夠檢測14 種常見的高危型HPV-DNA 型，如HPV16、18、31、33、35 等，大多數與宮頸癌有密切相關性。提示該檢測方法在女性HPV-DNA篩查中有重要作用[6]。高危型HPV 作為與宮頸癌病發有密切關系的因素，通過熒光定量PCR 檢測HPV，于PCR 的基礎上再結合熒光探針，使用核酸擴增檢測試劑進行基因擴增反應，把HPV 分型，從而實現對HPV 早期、高效、簡單的檢測。在亞臨床患者當中發現高危型陽性病例，繼而有效管控癌前病變，通過定期隨訪，對發病者及時治療，預防宮頸癌的發生，最大程度上避免宮頸癌的發展與擴散。

同時，熒光探針PCR 法還有操作簡單、檢測快速且成本較低的優勢，這些也決定了其適用于大規模人群的體檢初篩[7]。但是應注意，對于一些低危型HPV 感染引起的疾病檢測，熒光探針PCR法尚有不足之處，可結合其他篩查手段進一步得到篩查結果[8]。

綜上所述，熒光定量CPR法是HPV-DNA有效的臨床檢測技術，在檢測常見的高危型HPV 方面有較好結果，可用于女性大規模體檢初篩。