3種植物生長調節劑對高山杜鵑組培苗保存的影響

李莎莎，李雪嬌，趙正雄，解瑋佳，李世峰，宋 杰，張 露，彭綠春，*

（1.云南農業大學，云南 昆明 650205；2.云南省農業科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心/云南省花卉育種重點實驗室/云南花卉技術工程研究中心，云南 昆明 650205）

0 引言

杜鵑花屬(RhododendronL.)是世界著名的木本花卉，其花冠碩大、顏色鮮艷，觀賞價值高，是近年來中國年宵花和高檔園林造景的新秀，市場前景較好［1，2］。杜鵑通常采用嫁接、扦插、播種等方法繁殖［3］，但這些繁殖方法會受母株材料、季節等因素的影響且工作量大，不宜進行大規模生產。杜鵑組織培養體系的建立不僅可以加快繁殖速度，而且不受季節影響，對杜鵑的引種和規模化、商業化生產具有重要意義［4］。在試管苗繼代保存過程中，隨著培養基中營養物質耗盡和失水干裂，需將試管苗接種到新的培養基中，但多次繼代繁殖會導致組培苗繁殖能力下降，變異概率提高，同時也增加了繁瑣的人工操作過程［5］，因此，通過添加植物生長調節劑來延緩植物生長以減少繼代培養的次數，對杜鵑種質資源的保存具有重要意義。

在高山杜鵑的生產過程中，新品種培育和種質保存日益受到關注，植物種質資源離體保存主要是利用生物技術，在無菌培養條件下，通過添加各類生長抑制劑，使植物生長延緩或停止，減少繼代次數，以達到長期保存的目的［6］。植物離體保存技術包括緩慢生長離體保存和超低溫離體保存2種［7］，緩慢生長離體保存是在常規培養條件下對培養材料限制生長的保存方法，保存時間較短，需定期繼代；超低溫保存是指在-80 ℃以下的溫度（一般用液氮）對植物種質資源進行保存，超低溫保存一般有4種方法，即玻璃化法超低溫保存、小滴玻璃化法超低溫保存、包埋玻璃化法超低溫保存和包埋脫水法超低溫保存［8-9］，無需繼代，品種不容易發生變異［10］，但超低溫保存植物的生長恢復周期較長。

植物生長調節劑是由人工合成用于調節植物生長發育的化學物質，對植物生長具有重要的調控作用，可以促進插條生根、控制株形、調控花期、提高抗逆性，并且還能解除休眠，增加分蘗和分球數目，提高繁殖率［11-12］。在果蔬作物、農業經濟作物和觀賞植物等方面的應用較廣。王曉蔓等［5］在蘋果組培苗的繼代培養基中加入不同濃度的B9、矮壯素、PP333及脫落酸，結果表明：B9、矮壯素均有明顯的抑制作用，且莖尖存活率高，試管苗生長狀況較好；蔣元斌［13］用B9、PP333和ABA分別對芋頭種質進行離體保存，結果表明：3種植物生長延緩劑均能有效提高芋頭試管苗的成活率；晉玲等［14］用ABA、PP333保存秦艽愈傷組織取得了較好的效果；趙云龍等［15］用不同濃度的B9、PP333均可延緩大白杜鵑的生長；解瑋佳等［16］用不同濃度的矮壯素、PP333處理高山杜鵑，均可使其分枝變短增粗，延緩其生長；顧地周等［17］采用添加根皮苷的試管保存方法，結果表明：在試管內采取延緩生長法保存牛皮杜鵑叢生芽團是切實可行的新方法。

目前，對杜鵑組培苗延緩生長保存的研究較少，為了探索植物生長調節劑對高山杜鵑生長和抗逆性的影響，本文以2種高山杜鵑組培苗為材料，研究不同濃度的植物生長調節劑對高山杜鵑組培苗種質延緩生長保存的影響。為種質保存中減少繼代培養的次數、提升種苗品質和煉苗移栽成活率等方面提供借鑒參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的高山杜鵑組培苗為紅粉佳人、諾娃，培養條件：光照強度2000 lx，光照時間12 h/d，培養溫度（25±2） ℃。選用的植物生長調節劑為根皮苷、B9、PP333。試驗于2020年9月—2021年6月在云南省農業科學院花卉研究所組織培養實驗室內進行。

1.2 試驗方法

以增殖培養30 d且長勢一致的高山杜鵑瓶苗為試驗材料，切取植株頂部往下約2 cm的莖段，分別接種于添加了不同濃度根皮苷、B9、PP333的繼代培養基中，繼代培養基為WPM+1 mg/L ZT+0.05 mg/L NAA，pH值為5.4。3種生長調節劑均分別設置5個濃度梯度，根皮苷濃度分別為0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，B9濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，PP333濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，均以濃度0 mg/L作為空白對照，每個濃度設3個重復，每個重復接種15個帶頂芽莖段。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 形態指標的測定 將高度一致的杜鵑組培苗接入含有相應生長調節劑的繼代培養基中，用直尺測量培養基表面以上的植株高度，記為h1；3種生長調節劑處理90 d后，測量培養基表面以上的植株高度，記為h2，計算公式如下：

生長量(cm)=h2-h1

恢復出芽率(%)=植株恢復生長后萌發的新芽數/延緩生長后接入普通繼代培養基中的植株數×100%

1.3.2 生理抗逆指標的測定 3種生長調節劑處理90 d后，分別從對照及各個處理的每個重復中，隨機取0.5 g植株，進行可溶性蛋白質含量、丙二醛含量（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和葉綠素含量等生理指標的測定，具體操作方法參照試劑盒說明書，以上試劑盒均購買自上海優選生物科技有限公司。

1.4 恢復生長

3種生長調節劑處理90 d后，將處理后的試管苗轉接到繼代培養基中進行恢復培養，觀察并統計生長情況。

1.5 數據處理

原始數據用Excel軟件進行統計分析，采用SPSS 18.0軟件分析不同處理間分化率和分化不定芽數的差異顯著性，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同生長調節劑對高山杜鵑形態的影響

由圖1可知，與對照相比，經根皮苷處理90 d后的2種高山杜鵑植株的生長量顯著降低，試管苗節間縮短，莖稈粗壯（圖1B、圖1F），諾娃植株有一定的矮化效果，部分葉片皺縮變紅；經B9處理90 d后紅粉佳人的矮化效果與其對照植株（圖1A）相比差異不顯著（圖1C），諾娃植株上部分葉片變紅（圖1G）；經PP333處理90 d后2種高山杜鵑植株的矮化效果較對照最為顯著（圖1D、圖1H），紅粉佳人植株的葉片亮綠，生長狀況良好，諾娃植株部分葉片變紅，頂芽生長受到抑制，頂部有部分葉片出現萎蔫現象。

圖1 3種生長調節劑處理對2種高山杜鵑形態的影響

2.2 根皮苷對高山杜鵑組培苗延緩生長的影響

由表1可知，經不同濃度根皮苷培養90 d后，2種高山杜鵑的生長量較對照顯著降低，矮化效果顯著，表現出明顯的抑制生長作用，其中諾娃的矮化效果更顯著。紅粉佳人的生長量在根皮苷濃度介于1.5～2.5 mg/L范圍時，逐漸降低，濃度至2.5 mg/L時最低，矮化效果最顯著，濃度為3.0 mg/L時其生長量又快速增至最大，此時無矮化效果；添加根皮苷對紅粉佳人的恢復出芽率存在不同程度的抑制作用。根皮苷處理中諾娃的生長量顯著低于對照，并且隨根皮苷濃度的增加，生長量顯著降低，在根皮苷濃度為1.5 mg/L時明顯的無矮化效果，當根皮苷濃度介于2.0～3.0 mg/L范圍時，其生長量隨著濃度升高而顯著降低，當濃度為3.0 mg/L時其生長量降至最低，此時矮化效果最顯著，而諾娃的恢復出芽率隨著根皮苷濃度增加而提高。

表1 不同濃度的根皮苷處理對2種高山杜鵑組培苗生長的影響

由表2可知，隨著根皮苷濃度的增加，紅粉佳人的可溶性蛋白含量略微降低，但較對照均無顯著性差異；MDA和葉綠素含量以及SOD活性隨根皮苷濃度的增加而提高，其中根皮苷濃度為2.5 mg/L時的MDA含量和SOD活性顯著高于0～2 mg/L的處理，根皮苷濃度3 mg/L時，MDA含量和SOD活性下降，但與2.5 mg/L的處理差異不顯著；根皮苷濃度為2 mg/L時葉綠素含量顯著高于0～1.5 mg/L的處理，之后下降但與2 mg/L的處理差異不顯著。隨著根皮苷濃度的增加，諾娃的可溶性蛋白含量，與對照相比無顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量均隨著根皮苷濃度的升高而增加，當根皮苷濃度為3.0 mg/L時的含量均達到最高，較對照及其他處理具有顯著性差異；綜上所述，適合紅粉佳人和諾娃延緩生長保存的根皮苷濃度分別為2.5和3.0 mg/L。

表2 不同濃度的根皮苷對2種高山杜鵑組培苗生理指標的影響

2.3 B9對高山杜鵑組培苗延緩生長的影響

由表3可知，與對照相比，在B9濃度介于1.0～2.0 mg/L時，紅粉佳人的生長量逐漸增加，無矮化效果；當濃度為2.5 mg/L時，其生長量最低，矮化效果最顯著，恢復出芽率隨B9濃度增加而升高。在B9濃度介于2.0～2.5 mg/L時，諾娃的生長量逐漸減少且顯著低于對照，當濃度為2.5 mg/L時，其生長量達到最低，矮化效果最顯著，恢復出芽率隨B9濃度增加而不斷升高。

表3 不同濃度B9對2種高山杜鵑組培苗生長的影響

由表4可知，除了B9濃度為1.0與2.0 mg/L之間的差異顯著外，紅粉佳人其他各處理之間的可溶性蛋白含量無顯著性差異；MDA含量、葉綠素含量及SOD活性隨B9濃度的增加而升高，當B9濃度為1.5、2.0和2.5 mg/L時，其MDA含量和SOD活性無顯著差異，且均顯著高于對照，當B9濃度為2.5 mg/L時，葉綠素含量顯著高于對照。諾娃的可溶性蛋白含量無明顯提高，不同濃度B9處理與對照相比無顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量隨著B9濃度的升高而增加，濃度為2.5 mg/L時含量均達到最高，較對照均具有顯著性差異。綜上所述，適合紅粉佳人和諾娃延緩生長保存的B9最佳濃度均為2.5 mg/L。

表4 不同濃度B9對2種高山杜鵑組培苗生理指標的影響

2.4 PP333對高山杜鵑組培苗延緩生長的影響

由表5可知，紅粉佳人和諾娃的生長量在5個PP333濃度處理下均大幅降低，顯著低于對照，且各濃度處理下的生長量之間無顯著差異，說明PP333對2種高山杜鵑植株矮化的作用濃度低；而紅粉佳人和諾娃的恢復出芽率均是隨PP333濃度增加而提高。

表5 不同濃度PP333對2種高山杜鵑組培苗生長的影響

由表6可知，隨著PP333濃度的增加，紅粉佳人的可溶性蛋白含量有所下降，但各處理之間與對照無顯著性差異；MDA含量、SOD活性均隨著PP333濃度的增加而提高，均在濃度為2.5 mg/L時達到最高，較對照差異顯著；葉綠素含量在1.0～1.5、2.0～2.5 mg/L這2個濃度梯度處理下增加，在濃度為2.5 mg/L達到最高。隨著PP333濃度的增加，諾娃的可溶性蛋白含量與對照相比無顯著性差異；MDA含量、SOD活性、葉綠素含量均隨著PP333濃度的升高呈現波動上升的變化趨勢，在濃度為1.0 mg/L時達到最高，較對照均具有顯著性差異。綜上所述，紅粉佳人最佳的PP333處理濃度為2.5 mg/L，諾娃最佳的PP333處理濃度為1.0 mg/L。

表6 不同濃度PP333對2種高山杜鵑組培苗生理指標的影響

3 結論與討論

2種高山杜鵑在延緩生長保存期間，根皮苷、B9、PP333均能明顯抑制杜鵑組培苗的生長，在對照及各濃度處理間，可溶性蛋白含量無顯著差異，而與對照相比，SOD活性、 MDA、葉綠素含量呈現一定的差異性變化，其中，SOD活性、葉綠素含量隨生長調節劑濃度的增加而提高，且各個處理之間存在顯著差異。延緩生長保存的組培苗轉入繼代培養基后當代即可恢復生長。本研究篩選出紅粉佳人最適宜的3種生長調節劑的濃度為根皮苷2.5 mg/L、B92.5 mg/L、PP3332.5 mg/L；諾娃最適宜的濃度為根皮苷3.0 mg/L、B92.5 mg/L，PP3331.0 mg/L，且3種生長調節劑對諾娃的處理效果明顯優于對紅粉佳人。

延緩生長保存法可以避免頻繁繼代造成污染或引發種質變異，從而有效地保證種質的遺傳穩定性，達到植物種質資源中期保存目的［18］。向培養基中添加適宜質量濃度的植物生長延緩劑是植物組織培養物緩慢生長保存的有效方法［19］。植物生長延緩劑是通過抑制赤霉素的生物合成來抑制植物頂端分生組織的生長，從而延緩植物的生長［20］。研究表明，調整培養基中植物生長延緩劑的種類和比例，不僅能延長培養物在試管中的保存時間，而且能提高試管苗的素質和移植成活率。培養基中添加生長延緩劑，可達到延緩生長、延長保存時間的目的，方法簡單，每隔半年以上轉接1次可實現一定時間的保存，但在實際工作中，針對不同品種的試管苗，不同植物生長延緩劑或抑制劑的效果也會有所差異。同一種抑制劑應用在不同的植物中，效果也不一樣。

根皮苷、B9、PP333等作為高效、低毒的植物生長調節劑，在試管苗的延緩生長保存中效果較好且應用比較廣泛。但不同生長延緩劑對不同種類試管苗的抑制作用有所不同，顧地周等［17］采用添加根皮苷的培養基進行杜鵑組培苗的延緩保存，研究表明：在試管內采取延緩生長法保存牛皮杜鵑叢生芽團是切實可行的。趙喜亭等［18］研究表明PP333、B9均可延緩懷山藥試管苗的生長，PP333的保存效果優于B9。艾辛等［21］研究表明：在MS培養基中添加4.80 mg/L PP333時，馬鈴薯脫毒試管苗保存時間最長可達到300 d。王家福等［22］在枇杷種質資源離體保存試驗中證明，濃度介于2～5 mg/L的PP333有抑制枇杷試管苗生長的作用。董志君等［23］研究表明：施用PP333可有效矮化芍藥，以上研究結果均與本研究試驗結論一致。

本研究通過對2種高山杜鵑組培苗生理指標的測定分析，發現3種生長調節劑在延緩高山杜鵑組培苗生長的同時，也提高了高山杜鵑滲透調節物質的含量和抗氧化酶的活性，并增強其抗逆性，與朱茂成等［24］對米老排幼苗、馮斗等［25］對甜高粱幼苗的研究結果一致。但目前關于高山杜鵑方面的相關研究仍較少。