響應面法優(yōu)化凹紋胡蜂蜂房多糖提取工藝及抗氧化性研究

王振吉，楊申明，陳 靖，王欣怡

（楚雄師范學院 資源環(huán)境與化學學院，云南 楚雄 675000）

蜂房(Nidus Vespae)，又稱露蜂房、紫金沙等，為胡蜂科昆蟲果馬蜂(Polistes olivaceousDeGeer)、日本長腳胡蜂(P. japonicusSaussure)或異腹胡蜂(P. variaFabricius)的巢［1-2］。蜂房藥用歷史悠久，在《神農本草經》中記載，具有消腫散結、攻毒殺蟲之功效，臨床上常用來治療瘡瘍腫毒、牙痛、乳癰、瘰疬等病癥［3］。蜂房的化學成分復雜，不僅有昆蟲的共性成分，而且有植物源性成分，主要含有含黃酮、萜類、甾類等多種化學成分［4］。大量研究表明，蜂房在治療腫瘤及多種炎癥方面具有顯著療效，在醫(yī)藥領域中有廣泛應用前景。

凹紋胡蜂(Vespa arariaSmith)又稱葫蘆蜂、白腳蜂等，屬于胡蜂總科胡蜂屬，主要分布于云南、四川等地［5］。該胡蜂可造大型巢，具有重要應用價值［6］。王振吉等［7］研究表明：從凹紋胡蜂蜂房提取的總黃酮有一定的抗氧化性；楊新周等［8］研究表明：用水浴回流法可同時提取凹紋胡蜂蜂巢中的黃酮、多酚、多糖等成分，且蜂巢不同部位均具有一定的抗氧化性。其他有關凹紋胡蜂蜂房的研究鮮見報道，大部分凹紋胡蜂蜂房沒有得到有效利用，造成了蜂房資源的浪費。多糖(Polysaccharide)普遍存在于自然界動植物中［9］，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)等生理活性［10-12］。若能從凹紋胡蜂蜂房中提取多糖類物質，并用于醫(yī)藥領域中，對于凹紋胡蜂資源利用具有重要意義。

目前，有關VASNVP提取工藝及抗氧化性的研究鮮見報道。為此本研究采用凹紋胡蜂蜂房為試驗材料，利用纖維素酶協(xié)同超聲輔助提取VASNVP，通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化VASNVP提取工藝。同時，通過測定VASNVP對羥基自由基、DPPH自由基的清除能力和Fe3+的還原能力來評價其多糖抗氧化性，旨在為VASNVP在醫(yī)藥領域中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凹紋胡蜂蜂房，產自云南省廣通鎮(zhèn)，經鑒定為凹紋胡蜂的巢。葡萄糖標準品，HPLC≥98%，上海索萊寶科技有限公司；纖維素酶（酶活力50000 U/g），天津諾奧科技發(fā)展有限公司；DPPH自由基，上海藍季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5500型分光光度計，由上海元析儀器有限公司生產；SK8210HP 型超聲波清洗器，由上海科導超聲儀器有限公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 VASNVP提取工藝流程 凹紋胡蜂蜂房→曬干→粉碎→過篩（60目）→石油醚脫脂→烘干（55 ℃）→稱量→纖維素酶協(xié)同超聲波提取→減壓抽濾→Sevag法脫蛋白→溶液定容至50 mL容量瓶→得到凹紋胡蜂蜂房多糖提取液。

1.3.2 多糖含量的測定 以葡萄糖為標準品，利用苯酚—濃硫酸法測定多糖含量［13］。由測定的吸光度和葡萄糖標準溶液質量濃度，得到標準曲線方程A=64.536C-0.0453，相關系數R2=0.9997。多糖含量的計算公式為：

式（1）中：C為供試品溶液中多糖質量濃度(mg/mL)；V為定容體積（mL）；N為稀釋倍數；M為凹紋胡蜂蜂房干粉質量(g)。

1.3.3 單因素試驗 探究超聲功率分別為200、250、300、350、400 W下提取VASNVP，超聲溫度50℃，超聲時間70 min，液料比(mL/g)50∶1，纖維素酶用量6.0%；確定了超聲功率300 W提取效果較好后，探究超聲溫度分別為40、45、50、55、60 ℃下提取VASNVP，超聲時間70 min，液料比(mL/g)50∶ 1，纖維素酶用量6.0%；確定了超聲溫度50 ℃提取效果較好后，探究超聲時間分別為50、60、70、80、90 min下提取VASNVP，超聲功率300 W，液料比(mL/g)50∶1，纖維素酶用量6.0%；確定了超聲時間70 min提取效果較好后，探究液料比(mL/g)分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1下 提 取VASNVP，超聲功率300 W，超聲溫度50 ℃，纖維素酶用量6.0%；確定了料液比(mL/g)為50∶1提取效果較好后，探究纖維素酶用量分別為4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%下提取VASNVP，超聲功率300 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間70 min，從而確定纖維素酶的最佳用量。

1.3.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選取影響因素較大的超聲溫度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)、纖維素酶用量(D)為自變量，以VASNVP提取量為響應值，設計4因素3水平響應曲面試驗，優(yōu)化提取工藝條件（表1）。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.3.5 VASNVP抗氧化性測定 將VASNVP溶液配制成5種不同質量濃度（0.005082、0.010164、0.015246、0.020328、0.02541 mg/mL），測定其抗氧化性。

1.3.5.1 VASNVP對羥基自由基(·OH)的清除作用 參照Chen等［14］方法測定VASNVP對·OH的清除能力。以維生素C(VC)作陽性對照，按式（2）計算VASNVP對·OH的清除率：

1.3.5.2 VASNVP對DPPH自由基的清除作用 參照許世浩等［15］方法測定VASNVP對DPPH·的清除能力。以VC作陽性對照，按式（3）計算VASNVP對DPPH·的清除率：

1.3.5.3 VASNVP還原能力的測定 分別在5支試管中加1 mL不同質量濃度VASNVP，加1%鐵氰化鉀和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）各2 mL，混勻，在50 ℃中恒溫水浴20 min，加2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，離心，取2 mL上清液，加2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應10 min后，測定在700 nm波長處的吸光度，以VC作陽性對照［16］。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

超聲功率、超聲溫度、超聲時間、液料比和纖維素酶用量對VASNVP提取量的影響結果如圖1所示。

圖1 不同提取條件對VASNVP提取量的影響

由圖1a可知，當超聲功率增大至300 W時，VASNVP提取量達到最大值，為5.79 mg/g。這可能是因為超聲功率增加，增大了超聲波機械攪拌作用，有利于多糖溶出；之后若再增大超聲波功率，多糖提取量反而有減少的趨勢。因此，適宜的超聲功率在300 W左右。

由圖1b可知，當超聲溫度升高至45 ℃時，VASNVP提取量達到最大值，為5.93 mg/g。這可能是隨著超聲溫度升高，纖維素酶活力增大，但當超聲溫度超過纖維素酶最適宜溫度后，酶失去活性，導致提取量下降。因此，適宜超聲溫度在45℃左右。

由圖1c可知，當超聲提取時間增加至70 min時，VASNVP提取量達到最大值，為5.86 mg/g。這可能是超聲時間達到70 min時VASNVP能最大程度地溶出，之后隨著超聲時間增加，纖維素酶容易變質而失去活性，導致多糖提取率下降。因此，適宜超聲時間在70 min左右。

由圖1d可知，隨著液料比增大，VASNVP提取量呈先增大后減少的變化趨勢。這可能是因為溶劑用量增加，凹紋胡蜂蜂房與溶劑接觸面增大，提取量增加。當液料比(mL/g)達到50∶1時，VAS-NVP提取量達到最大值，為5.82 mg/g。之后繼續(xù)增大液料比，VASNVP提取量呈減小的趨勢。因此，適宜的液料比(mL/g)為50∶1左右。

由圖1e可知，當纖維素酶用量增加至6.0%時，VASNVP提取量達到最大值，為5.98 mg/g。之后VASNVP提取量隨著酶用量增加而下降。這可能是酶用量低于最佳值時酶解不完全，達到最佳值時酶解完全；此時如果繼續(xù)加大酶量，底物濃度不能使酶達到飽和，導致酶作用受到抑制［17］。因此，適宜纖維素酶用量為6.0%左右。

2.2 響應面法優(yōu)化VASNVP工藝條件

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據中心組合試驗設計原理，利用響應面試驗優(yōu)化提取工藝條件，試驗設計及結果如表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析 對表2中的數據進行回歸分析，得到VASNVP提取量對編碼自變量的回歸方程為：Y=6.00-0.018A-0.21B+0.10C-0.21D-0.13AB-0.060AC-0.21AD-0.15BC-0.094BD-0.10CD-0.33A2-0.34B2-0.17C2-0.39D2。說明所考察的4個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。回歸方程顯著性檢驗及方差分析的結果見表3。

由表3可知，該模型P＜0.0001，說明此模型達到極顯著。失擬項P=0.054＞0.05，表示擬合程度較高，試驗誤差小，可用于設計試驗范圍內的預測。超聲時間(B)、液料比(C)、纖維素酶用量(D)、超聲溫度與超聲時間的交互項(AB)、超聲溫度與纖維素酶用量的交互項(AD)、超聲時間與液料比的交互項(BC)、液料比與纖維素酶用量的交互項(CD)、超聲溫度的二次(A2)、超聲時間的二次項(B2)、液料比的二次項(C2)、纖維素酶用量的二次項(D2)等對VASNVP提取量的影響極顯著（P＜0.01），超聲時間與纖維素酶用量的交互項(BD)對VASNVP提取量的影響顯著（P＜0.05），說明上述這些因素對VASNVP提取量影響大，改變這些因素的水平會對響應值產生極顯著的影響。

由表3中F值大小可知，影響VASNVP提取量的主次順序為纖維素酶用量＞超聲時間＞液料比＞超聲溫度，其中，纖維素酶用量對VASNVP的影響程度最大。回歸模型系數R2=0.9758，說明此模型能解釋97.58%響應值的變化，且模型R2Adj=0.9515＞0.8，說明此回歸方程擬合度和可信度均很高。因此，此模型可用于代替真實試驗點對VASNVP提取和預測。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

2.2.3 驗證性試驗 根據所得模型，應用Design-Expert 8.0.5 b軟件分析，得到VASNVP最佳提取條件為超聲溫度51.01 ℃、超聲時間65.95 min、液料比(mL/g)為55.56∶1、纖維素酶用量5.68%，VASNVP提取量預測值為6.10 mg/g。考慮到實際試驗情況，提取條件修正為：超聲溫度51.0 ℃、超聲時間66.0 min、液料比(mL/g)為56∶1、纖維素酶用量5.7%，在此條件下得到VASNVP提取量平均值為6.08 mg/g，理論值與實際值相對標準偏差為0.33%。

2.3 VASNVP抗氧化性分析

2.3.1 ·OH清除能力的測定 由圖2可知，在VASNVP質量濃度為0.005082～0.02510 mg/mL范圍內的時候，隨著VASNVP質量濃度的增大，清除·OH的能力不斷增強。當VASNVP質量濃度為0.02541 mg/mL時，對·OH的清除率為52.41%，與陽性對照VC的清除率（93.13%）相比較弱，但VASNVP也有一定的清除羥基自由基的能力。

圖2 不同質量濃度VASNVP對羥基自由基的清除效果

2.3.2 DPPH·清除能力的測定 從圖3可知，隨著VASNVP濃度的增大，其清除DPPH·的能力也逐漸增強。在VASNVP質量濃度為0.00502～0.02510 mg/mL的范圍內，DPPH·的清除率為最大52.41%，此時多糖質量濃度為0.02510 mg/mL，盡管VASNVP清除DPPH·的效果稍差于陽性對照VC的，但是VASNVP依然表現出清除DPPH·的能力較強，表明VASNVP具有較好的抗氧化能力。

圖3 不同質量濃度VASNVP對DPPH自由基的清除效果

2.3.3 Fe3+還原能力的測定 由圖4可知，在VASNVP質量濃度為0.00502～0.02510 mg/mL范圍時，VASNVP的還原能力隨濃度的增大而增強。當其質量濃度為0.02510 mg/mL時，使Fe3+還原產生的吸光度值為0.326，較陽性對照VC的還原能力（吸光度值為0.351）稍弱，這表明VASNVP對Fe3+具有很強的還原能力。

圖4 不同質量濃度VASNVP對Fe3+的還原能力

3 結論

本文采用纖維素酶協(xié)同超聲輔助提取VASNVP，通過響應面法優(yōu)化了VASNVP提取工藝條件。優(yōu)化得到VASNVP最佳工藝條件：超聲溫度51.0 ℃、超聲時間66.0 min、液料比(mL/g)56∶1、纖維素酶用量5.7%，在此條件下VASNVP提取量平均值為6.08 mg/g，與預測值(6.10 mg/g)接近，預測值與實際值相對標準偏差為0.33%。說明運用響應面法進行分析的數據可靠，有一定的實用價值，并能用于生產實際。

抗氧化性試驗結果表明，當VASNVP質量濃度在0.00502～0.02510 mg/g范圍內時，隨著VASNVP質量濃度的增加，其清除·OH 、DPPH·的能力和對Fe3+的還原能力增強，即VASNVP質量濃度與清除率和Fe3+還原能力有量效關系。VASNVP具有一定的抗氧化能力，可作為抗氧化劑資源進行開發(fā)利用。