外周血PTX3、LAC、miR-155在肺部感染表達(dá)及對生存狀況的預(yù)測價值

何凌，魯玉婷

（1.漯河市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 漯河 462000；2.漯河市中醫(yī)院內(nèi)二科，河南 漯河 462000）

重癥肺部感染多由致病力強(qiáng)的細(xì)菌或多種細(xì)菌混合感染所致，病程進(jìn)展迅速，可造成多器官功能性衰竭，最終導(dǎo)致死亡[1-2]。因此早期及時準(zhǔn)確診斷，給予積極抗感染治療對控制肺部感染病情進(jìn)展及提高生存率具有積極意義。研究顯示，肺防御機(jī)制可避免宿主受潛在病原體侵害，而先天免疫通過調(diào)控可溶性模式識別受體的分泌，有助于識別病原體與受損組織[3]，正五聚蛋白3（PTX3）作為一種可溶性模式識別受體，在宿主免疫反應(yīng)調(diào)控過程中可能發(fā)揮重要作用[4]。同時，文獻(xiàn)證實，微小RNA（mi RNA）在感染性疾病的免疫調(diào)控過程中具有重要作用[5]，而miR-155作為其重要成員之一，參與B細(xì)胞應(yīng)答與T細(xì)胞應(yīng)答。另有學(xué)者認(rèn)為，血乳酸（LAC）水平升高是組織灌注與氧輸送不足的早期敏感生化指標(biāo)，有望成為判斷疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)之一[6]。但外周血PTX3、LAC、mi R-155不同表達(dá)水平與肺部感染患者生存狀況的關(guān)聯(lián)性仍需大量數(shù)據(jù)支持?；诖耍狙芯烤C合分析外周血PTX3、LAC、miR-155在肺部感染表達(dá)及對生存狀況的預(yù)測價值。報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年10月至2019年10月在我院呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房接受治療的重癥肺部感染患者102例作為研究組，同期選取74例健康體檢者作為對照組。其中研究組女40例，男62例，年齡55～75歲，平均（60.28±4.15）歲；對照組女29例，男45例，年齡51～76歲，平均（59.77±3.89）歲。兩組基本資料（年齡、性別）均衡可比（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究組均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)：屬重癥肺部感染：①呼吸頻率＞30次/min、血氣分析異常；②體溫≥39℃或≤36℃；③經(jīng)胸部CT檢查顯示肺滲出性病理變化或入院48 h浸潤面積＞50.0%；④急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分Ⅱ≥8分。（2）兩組臨床資料完整，且患者及家屬均簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并腦血管意外、重度心力衰竭、急性心肌梗死、惡性腫瘤等疾??；（2）近14 d內(nèi)伴有其他部位嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷或活動性肺結(jié)核者；（3）近期有激素或其他免疫抑制劑使用史者；（4）存在其他部位感染者；（5）合并甲狀腺功能異常、自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)慢性疾病者；（6）精神行為異常者。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 （1）空腹取6 mL靜脈血，3 000 r/min離心12 min，分離取血清，置于-70℃低溫保存：①采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測PTX3水平，試劑盒購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；②采用實時熒光定量PCR儀檢測miR-155水平，儀器購自美國ABI公司，具體操作：將250 μL血清置入1.5 mL已除酶的離心管內(nèi)，加入焦炭酸二乙酯250μL稀釋，后分別加入水飽和酚、三氯甲烷250μL，震蕩混勻，靜置60 s，離心收集上清液，置入醋酸鈉溶液 （約為上清液體積的10.0%）、異丙醇，震蕩混勻，離心去除上清液，留取RNA沉淀物，置入75%乙醇1 mL，渦旋混勻離心，留取沉淀，加入焦炭酸二乙酯水20 mL，溶解RNA沉淀，置入-70℃低溫保存。利用Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫確定miRNA特征。采用反轉(zhuǎn)錄引物及PCR正向引物、負(fù)向引物，取反轉(zhuǎn)錄引物（10μmol/L）1μL，加入RNase Free H2O 9μL配制成工作液1μmol/L。反轉(zhuǎn)錄條件：30℃10 min，42℃20 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5 min（酶失活反應(yīng)），4℃5 min。于RT-PCR反應(yīng)體系加入反應(yīng)產(chǎn)物1μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，循環(huán)40次。應(yīng)用公式2-ΔΔct計算miR-155相對表達(dá)量。（2）空腹取2 mL橈動脈血，采用床邊血氣分析儀（型號：Cobosb 221）檢測LAC水平，儀器購自瑞士羅氏公司，嚴(yán)格按照儀器說明書執(zhí)行。

1.3.2 治療方法 研究組均予以抗感染、營養(yǎng)支持、化痰、霧化吸入、調(diào)整水電解質(zhì)及血糖等基礎(chǔ)治療?？股貞?yīng)用則根據(jù)痰培養(yǎng)結(jié)果篩選。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較兩組外周血PTX3、LAC、mi R-155水平。（2）比較研究組存活及死亡患者入院前、入院后3 d、7 d外周血TX3、LAC、miR-155水平。（3）分析肺部感染患者死亡的影響因素。（4）分析入院后3 d、7 d外周血TX3、LAC、miR-155水平單一及入院7 d外周血各指標(biāo)聯(lián)合對肺部感染患者生存狀況的預(yù)測價值。（5）分析入院后3 d、7 d外周PTX3、LAC、mi R-155水平與肺部感染患者生存狀況的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Logistic進(jìn)行多因素回歸分析，采用受試者工作特征曲線（ROC）分析預(yù)測價值，以卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier，KM）進(jìn)行生存曲線分析，采用Log-Rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血各指標(biāo)表達(dá) 研究組患者外周血PTX3、LAC、mi R-155水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血各指標(biāo)表達(dá)（±s）

表1 兩組外周血各指標(biāo)表達(dá)（±s）

組別 n研究組對照組F值P值102 74 P T X3（ng/mL） L A C（mm ol/L）1.66±0.50 1.01±0.30 9.954＜0.001 150.19±45.06 50.38±15.11 18.310＜0.001 mi R-155 1.25±0.38 0.79±0.24 9.467＜0.001

2.2 研究組存活及死亡患者外周血各指標(biāo)表達(dá)隨訪28 d，研究組存活82例，死亡20例。研究組死亡患者入院后3 d、7 d外周血TX3、LAC、miR-155水平顯著高于生存患者（P＜0.05）。見表2。

表2 研究組存活及死亡患者外周血各指標(biāo)表達(dá)（±s）

表2 研究組存活及死亡患者外周血各指標(biāo)表達(dá)（±s）

項目 組別P T X3（ng/mL）n 82 20 L A C（mm ol/L）82 20 mi R-155存活死亡t值P值存活死亡t值P值存活死亡t值P值82 20入院當(dāng)天1.66±0.50 1.67±0.49 0.081 0.936 149.82±44.94 151.69±42.89 0.168 0.867 1.25±0.38 1.27±0.37 0.212 0.833入院后3 d 1.53±0.46 1.99±0.90 3.234 0.002 120.29±36.12 156.41±46.92 3.771＜0.001 1.13±0.34 1.47±0.42 3.823＜0.001入院后7 d 1.40±0.71 2.12±0.66 4.120＜0.001 110.36±55.18 165.54±49.62 4.085＜0.001 1.02±0.51 1.53±0.46 4.083＜0.001

2.3 Logistic回歸性分析影響患者死亡因素 以肺部感染患者是否死亡為因變量，入院后3 d、7 d PTX3、LAC、mi R-155為自變量進(jìn)行Logistic回歸性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，入院后3 d、7 d PTX3、LAC、mi R-155均為影響肺部感染患者死亡的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 Logistic回歸分析影響患者死亡因素

2.4 ROC分析各指標(biāo)單一預(yù)測生存狀況價值ROC曲線分析結(jié)果顯示，各指標(biāo)預(yù)測生存狀況價值的AUC結(jié)果為入院后7 d miR-155＞7 d LAC＞7 d PTX3＞3 d miR-155＞3 d LAC＞3 d PTX3。見表4、圖1。

表4 ROC分析各指標(biāo)單一預(yù)測生存狀況價值

圖1 各指標(biāo)單一預(yù)測生存狀況價值的ROC曲線

2.5 ROC分析各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測生存狀況價值 通過建立入院后7 d各指標(biāo)與生存狀況關(guān)系的Logistic回歸模型將入院后7 d各檢驗指標(biāo)轉(zhuǎn)化得到聯(lián)合檢測預(yù)測概率的預(yù)測變量PRE_1，并得到死亡 預(yù) 測 值 回 歸 方 程 為：P=1/[1+e-（-4.716+1.674X1+1.059X2+1.562X3）]（X1、X2、X3分別 為7 d PTX3、7 d LAC、7 d miR-155值），將每組各指標(biāo)代入方程得到預(yù)測概率值P，若P值≥PRE_1的臨界值即預(yù)測死亡。結(jié)果顯示，聯(lián)合預(yù)測死亡的AUC為0.890（95%CI：0.812～0.943），敏感度為80.00%，特異度為86.59%。見圖2。

圖2 各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測生存狀況價值的ROC曲線

2.6 外周血各指標(biāo)與生存狀況關(guān)系 根據(jù)ROC分析PTX3、LAC、miR-155最佳截斷值，入院后3 d、7 d PTX3分別＞1.46 ng/mL、＞1.59 ng/mL患者為PTX3高危組，LAC分別＞151.06 mmol/L、＞175.6 mmol/L患者為LAC高危組，miR-155分別＞1.46、＞1.50患者為miR-155高危組。K-M曲線分析，入院后3 d、7 d PTX3、LAC、miR-155高危組生存率低于PTX3、LAC、miR-155低危組（P＜0.05）。見圖3-5。

圖3 PTX3高危及低危組生存曲線

圖4 LAC高危及低危組生存曲線

圖5 miR-155高危及低危組生存曲線

3 討論

既往主要應(yīng)用各種評分系統(tǒng)評估肺部感染患者預(yù)后結(jié)局，雖操作簡便，但準(zhǔn)確度較差，而CRP等常用生化指標(biāo)又缺乏特異度，應(yīng)用于臨床預(yù)后評估價值有限。因此，探討一種敏感度與特異度均較好的指標(biāo)對于早期評估肺部感染患者預(yù)后具有重要臨床價值。

3.1 外周血PTX3在肺部感染表達(dá)及對生存狀況的預(yù)測價值 新近研究顯示[7-9]，PTX3作為一種典型的急性期蛋白，與感染預(yù)測典型指標(biāo)CRP相比，能迅速反映組織局部炎癥及損傷，有望成為臨床更加敏感的血清學(xué)標(biāo)志物。經(jīng)檢測肺部感染患者外周血PTX3水平發(fā)現(xiàn)，外周血PTX3水平在肺部感染患者中增加，與董春艷等[10]研究觀點基本一致，說明PTX3可能在肺部感染患者炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。肺部感染可能激活腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等炎癥信號因子，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放組織因子、PTX3，而PTX3通過正反饋一定程度可增加組織因子表達(dá)[11-12]；同時PTX3可與纖維母細(xì)胞生長因子2、補(bǔ)體clq等多種分子結(jié)合，激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑，進(jìn)而引發(fā)補(bǔ)體分子clq、c3b沉積，提高黏附分子表達(dá)，加重肺組織損傷。提示外周血PTX3有利于早期預(yù)測肺部感染嚴(yán)重程度，制定合理治療方案。ROC曲線分析提示，肺部感染患者入院后7 d外周血PTX3截斷點為1.59 ng/mL時，對肺部感染患者生存狀況評價敏感度高于同時期的外周血miR-155、LAC，在某種程度上間接反映了外周血PTX-3對肺部感染患者的近期預(yù)后具有研究潛力。進(jìn)一步經(jīng)K-M曲線可知，入院后3 d、7 d外周血PTX3高表達(dá)可能會增加肺部感染患者死亡風(fēng)險，結(jié)合既往研究分析[13]，可能與外周血PTX3過度表達(dá)對中性粒細(xì)胞在肺部聚集產(chǎn)生抑制作用有關(guān)。

3.2 外周血miR-155在肺部感染表達(dá)及對生存狀況的預(yù)測價值miRNA-155在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，對機(jī)體免疫調(diào)控起重要作用[14-15]。目前，關(guān)于血清miRNA-155與肺部相關(guān)疾病關(guān)系的研究較少，與肺部感染關(guān)系的研究也鮮有報道。李男等[16]報道指出，miR-155可能在肺部疾病中占據(jù)重要地位。本研究結(jié)果顯示，外周血mi R-155水平在肺部感染患者中過度表達(dá)。mi R-155通過抑制其下游的靶標(biāo)，即沉默細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1表達(dá)，引發(fā)炎性反應(yīng)失調(diào)，從而引發(fā)肺損傷[17]，并通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子fos/jun，從而調(diào)節(jié)微生物感染的一系列變化，參與病情進(jìn)展過程。推測miR-155可能作為潛在靶點用于肺部感染的診治。本研究通過Logistic多因素回歸性分析，入院后3 d、7 d mi R-155是影響肺部感染患者死亡的獨立危險因素，機(jī)制考慮為外周血miR-155水平上調(diào)可能加重肺部浸潤炎癥細(xì)胞，增多細(xì)胞因子，加劇肺組織損傷。通過繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，mi R-155預(yù)測肺部感染患者生存狀況特異度可達(dá)95.12%，有望成為預(yù)測肺部感染患者預(yù)后的有效指標(biāo)之一。

3.3 外周血LAC在肺部感染表達(dá)及對生存狀況的預(yù)測價值LAC是葡萄糖無氧代謝產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺氧時，易并發(fā)血LAC升高[18-19]，Hanis等[20]研究還顯示，LAC增加表明機(jī)體組織及細(xì)胞灌注與氧合受損。外周血LAC水平雖能反映某一時間點內(nèi)病情狀況，但受腎臟、肝臟及既往藥物應(yīng)用史等基礎(chǔ)狀態(tài)的影響，患者靜態(tài)LAC水平應(yīng)激強(qiáng)度往往不甚理想，難以有效準(zhǔn)確反映患者預(yù)后改變，故本研究選擇動態(tài)監(jiān)測肺部感染患者外周血LAC水平，數(shù)據(jù)表明，肺部感染死亡患者入院后3 d、7 d外周血LAC水平高于肺部感染存活患者，與丁莉等[21]研究結(jié)果基本一致，外周血LAC表達(dá)上調(diào)可能會加重組織灌注不足，引發(fā)嚴(yán)重組織缺氧，增加死亡風(fēng)險，提示外周血LAC對肺部感染患者生存狀況具有一定預(yù)測價值。另外，入院后7 d PTX3、LAC、miR-155均是肺部感染患者死亡發(fā)生的獨立危險因素，故三者聯(lián)合對于評估肺部感染患者生存狀況具有較好基礎(chǔ)，本研究通過建立入院后7 d各指標(biāo)與生存狀況關(guān)系的Logistic回歸模型將入院后7 d各檢驗指標(biāo)轉(zhuǎn)化得到聯(lián)合檢測預(yù)測概率的預(yù)測變量，利用此變量預(yù)測肺部感染患者死亡發(fā)生的AUC值達(dá)0.890，較單獨檢測得到明顯提升，提示聯(lián)合預(yù)測肺部感染患者死亡具有更高的臨床價值。推測三者聯(lián)合有望成為預(yù)測肺部感染患者生存狀況的有效手段，從而為臨床診治、預(yù)后評估提供新方向。

綜上可知，外周血PTX3、LAC、miR-155在肺部感染患者中過度表達(dá)，三者聯(lián)合具有預(yù)測肺部感染患者生存狀況的潛力，可為臨床診治與預(yù)后評估提供科學(xué)指導(dǎo)。