生物信息學分析MGP基因在卵巢癌中的表達情況及其與腫瘤免疫浸潤和患者預后的關系

崔洪全 張瀟藝 陳彬 馮其貞

（1上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院腫瘤科 蘇州 215028；2濟寧醫學院2018級臨床醫學五年制，3臨床醫學院外科學總論教研室 濟寧 272067）

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，通常晚期才被發現［1］。流行病學研究表明美國約80%的卵巢癌患者存在局部或遠處轉移［2］。影響卵巢癌患者預后的主要因素是分期水平，Ⅰ期患者的5年生存率為70%，而Ⅳ期患者的5年生存率僅為8%［3］。因此，識別卵巢癌患者預后的生物標志物和潛在的調節因子具有重要意義。近年來，卵巢癌的靶向治療和免疫治療為患者提供了新方向，其目的是通過激活T細胞，調節T細胞浸潤水平來延長患者生存時間［4］，同時有研究顯示免疫治療是刺激機體對腫瘤的免疫應答［5］。因此，進一步明確腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用及分子機制，可能為卵巢癌患者的免疫治療提供新的靶點。

羧基谷氨酸蛋白（matrix gamma linolenic acid protein，MGP）是在骨中發現的一種內源性小蛋白，由軟骨細胞分泌到細胞外基質中，在心臟、腎臟中均有表達。MGP通過與羥基磷灰石中的晶核結合，發揮鈣化抑制劑的功能，從而阻止晶體生長。MGP也是重要的局部血管鈣化抑制劑，可以接受兩種轉錄后修飾：維生素K-dependentγ-谷氨酸羧化和絲氨酸磷酸化［6］。已發現乳腺癌細胞系表達MGP，在乳腺癌MCF-7細胞中降低MGP表達，可導致腫瘤細胞增殖和侵襲能力增強。MGP在其他類型腫瘤中也有表達，如結腸癌、卵巢癌。我們應用生物信息學方法分析了MGP基因在卵巢癌組織中的表達情況，并發現MPG高表達與患者預后差密切相關；同時分析了MGP表達水平與卵巢癌免疫微環境的關系，為進一步研究其在卵巢癌發生發展中的作用和機制提供有價值的依據。

材料和方法

TCGA數據庫分析進入TCGA網站（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga），點擊Access TCGA Data，進入數據下載頁面；點擊Repository，在Cases選項中選擇ovary，在Program選項中選擇TCGA，在Project選項中選擇TCGAOV，在Files選項中選擇transcriptome profiling，在Data Type選項中選擇Gene Expression Quantification，在Experimental Strategy選項中選擇RNA-seq，在Workflow Type選項中選擇HTSeq-FPKM，最后點擊Add All Files to Cart，進入Cart頁面，在Download選 項 中 下 載Manifest、Cart、Metadata和Clinical文 件。

GTEX數據庫分析基因型組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEX）是一個大型人類組織mRNA數據集，為識別與基因表達變化相關的遺傳變異提供參考。通過UCSC Xena官網（https：//xena.ucsc.edu/）進 入GTEX數 據 下 載 頁面，下載gene expression RNAseq轉錄組TOIL RSEM fpkm格式數據和GTEX phenotype臨床信息。

TIMER網站分析進入TIMER官網（https：//cistrome.Shinyapps.io/timer）可查看到7個模塊。“Diff Exp”基因差異表達模塊通過箱線圖顯示基因在TCGA腫瘤組織和癌旁正常組織中的分布情況，并使用Wilcoxon檢驗對差異表達進行統計學分析。“Survival”生存模塊構建COX比例風險模型，協變量包括年齡、性別、種族、腫瘤分期和基因表達。通過Kaplan-Meier繪制生存曲線，通過log-rank檢驗比較兩組生存曲線的P值。該COX模型由R包“survival”中的函數coxph（）擬合；系數coef為 回 歸 系 數，HR為 風 險 比，95%CI_l和95%CI_u顯示上下95%CI。“Mutation”突變模塊通過箱線圖顯示不同基因突變狀態下免疫細胞浸潤水平的分布，并使用雙邊Wilcoxon秩和檢驗進行統計分析。“Correlation”相關性模塊通過散點圖繪制目標基因在腫瘤中的分布情況，并通過Spearman的rho值評估統計學意義，還提供了以腫瘤純度或年齡為條件的部分相關選項。

基因集富集分析GSEA方法是一組具有共同生物學功能、染色體位置或調節通路的基因［7］。本研究根據MGP基因表達水平將卵巢癌樣本分為高表達組和低表達組。使用GSEA_4.0.1版本軟件，在Gene sets database設置中分別選擇c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt［Curated］和c2.cp.biocarta.v7.4.symbols.gmt［Curated］，設 置 選 項 中Number of permutations選 擇1000，Phenotype labes選 擇h_versus_l。

統計學分析采用R 3.5.1軟件進行統計分析。通過limma包處理轉錄組數據，通過Wilcoxon檢驗分析兩組間差異。測量數據用x±s表示，計數數據用百分比（%）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

MGP在不同類型人類腫瘤中的mRNA表達水平MGP mRNA在各種腫瘤與鄰近正常組織間的表達差異如圖1A所示，在膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、結腸癌中MGP表達均低于癌旁組織。由于TCGA數據庫中無正常卵巢組織數據，我們結合GTEX數據庫發現，MGP在正常卵巢組織中高表達，而在卵巢癌組織中低表達（圖1B）。

圖1 MGP在泛癌組織中與正常組織中的表達情況Fig 1 Expression level of MGP in pan-cancer tissues and normal tissues

GSEA分析MGP基因在卵巢癌中富集的信號通路以KEGG基因集作為GSEA分析的參考基因集，MGP高表達組與細胞黏附分子、細胞因子受體相互作用、血管平滑肌收縮、腸道免疫球蛋白IgA、自然殺傷細胞介導細胞毒性等信號通路相關（圖2A）。以BIOCARTA基因集作為GSEA分析的參考基因集，MGP高表達組與CCR5通路、NKT通路、IL-17通路、Th1/Th2等通路有關（圖2B）。表明MGP可能通過上述生物學過程促進卵巢癌的發生發展，特別是與淋巴細胞和細胞因子密切相關。

圖2 GSEA分析MGP基因在卵巢癌中富集的信號通路Fig 2 GSEA analysis on the enriched signal pathway of MGP gene in ovarian cancer

MGP與卵巢癌免疫細胞浸潤的關系通過TIMER網站分析MGP表達與卵巢癌微環境中不同類型免疫細胞的相關性：MGP表達水平與CD8+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞呈正相關，而與腫瘤純度呈負相關（P＜0.05，圖3A）。通過分析MGP基因拷貝數發現，MGP基因缺失與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞的浸潤水平密切相關（圖3B）。

圖3 MGP表達水平和基因突變與免疫浸潤的關系Fig 3 Relationship between MGP expression level，gene mutation and immune infiltration

MGP和免疫細胞浸潤水平與卵巢癌患者預后的關系通過TIMER網站生存分析模塊，繪制免疫細胞浸潤和基因的Kaplan-Meier圖，通過logrank檢驗比較兩組生存曲線的P值。結果顯示，卵巢癌患者中CD4+T細胞、巨噬細胞浸潤水平和MGP表達水平與患者預后密切相關（P＜0.05，圖4）。高水平CD4+T細胞、低水平巨噬細胞和低水平MGP提示卵巢癌患者預后好。

圖4 MGP和免疫細胞浸潤水平與卵巢癌患者預后的關系Fig 4 Relationship between the level of MGP and immune cell infiltration and the prognosis of patients with ovarian cancer

MGP是卵巢癌患者的獨立預后因子通過構建COX回歸模型發現：患者年齡，巨噬細胞、中性粒細胞浸潤水平，MGP表達水平與患者預后呈正相關，而CD8、CD4 T細胞與患者預后呈負相關（P＜0.05，表1），即MGP高表達組患者預后更差。

表1 卵巢癌患者總生存影響因素的COX比例風險回歸模型分析Tab 1 COX proportional risk regression model analysis of factors influencing overall survival in ovarian cancer patients

MGP表達與免疫細胞相關基因的關系通過分析TIMER數據庫相關性模塊，使用Spearman的rho值評估統計差異并繪制散點圖，同時提供了以腫瘤純度或年齡為條件的部分相關選項。結果顯示，MGP與大多數免疫相關基因的相關性顯著，經過腫瘤純度或年齡調整后差異仍有統計學意義（P＜0.05，圖5，表2），圖5僅展示MGP與CD8A和CD8B基因的相關性。

圖5 MGP與CD8基因表達的相關性分析Fig 5 Correlation analysis of MGP and CD8 gene expression

表2 TIMER數據庫中MGP與免疫細胞相關基因的相關性分析Tab 2 Correlation analysis between MGP and relate genes and markers of immune cells in TIMER database

討 論

卵巢癌分期對患者5年生存率有重要影響。研究表明，MGP在病理性血管生成和腫瘤發生中發揮重要作用。在膠質母細胞瘤、宮頸癌和皮膚癌中均發現MGP表達水平升高，且與腫瘤進展呈正相關［8-9］。與正常組織中相比，MGP在多種實體瘤中表達下調。但是，我們在生存分析中發現MGP高表達組的卵巢癌患者預后更差，同時COX風險比例模型顯示MGP為高風險因素。

通過GSEA方法分析MGP基因在卵巢癌組織中的富集情況，結果顯示MGP富集于細胞黏附分子等信號通路。研究表明，細胞黏附分子PCDH18的低表達與頭頸鱗癌的整體生存較差相關，而MPG通過調節這一信號通路，導致患者預后不良［10］。MGP同時富集于細胞因子受體信號通路、血管平滑肌收縮信號通路、CCR5信號通路、NK7信號通路等，因此我們推測MGP可能通過這些信號通路調控卵巢癌的發生發展。

CD8可特異性標記細胞毒性T細胞。細胞毒性T細胞是一種在體內識別腫瘤抗原并分泌針對效應細胞的細胞因子的寡克隆T細胞群，并與免疫浸潤有關，因此在腫瘤清除中起積極作用。PD-L1和CD8+T細胞聯合誘導凋亡，并與過表達PDK1的卵巢癌細胞共培養可導致PD-L1表達增加，而PDK1的缺失則產生相反的作用［11］。我們通過GSEA分析MGP信號轉導途徑，其中幾條與免疫密切相關，包括biocarta_NKT_信號通路、biocarta_TH1TH2_信號通路和biocarta_IL17_信號通路等，這些通路在MGP高表達組中均有富集。通過分析mRNA的表達，腫瘤微環境中存在抗腫瘤和免疫抑制因子，卵巢癌組織中CD4+T細胞浸潤水平對生存率有影響，Kaplan-Meier生存曲線有顯著差異［12］。噬菌體在宿主對腫瘤的防御中起積極作用，免疫細胞浸潤影響卵巢癌的發生發展，尤其是T淋巴細胞的浸潤［13］。一些淋巴細胞促進腫瘤的發展，而另一些淋巴細胞則抑制腫瘤的發展。但兩者之間的機制尚不清楚，還需要進一步研究。

(續表2)

使用消炎藥可能降低卵巢癌的風險。阿司匹林等非甾體抗炎藥可能通過限制巨噬細胞的分化，發揮M2型巨噬細胞的免疫抑制作用，從而降低卵巢癌患者的風險。我們的數據顯示卵巢癌患者與巨噬細胞浸潤水平顯著相關，提示MGP可能與腫瘤相關巨噬細胞的極化有關。MGP影響腫瘤血管生成，MGP的表達水平與腫瘤血管形成有關。本研究顯示MGP表達增加與CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤呈正相關。同時卵巢癌中CD8+T細胞、CD4+T細胞浸潤水平與中性粒細胞和MGP表達均顯著相關。因此，我們推測MGP有激活CD4+T細胞和CD8+T細胞的潛力。此外，MGP表達與T細胞和B細胞標記基因的相關性提示MGP與卵巢癌腫瘤的免疫調節有關。首先，T細胞基因標記（如CCR7和CD3E），輔助T細胞Th1標記（如STAT4、INF-γ和INF-α）和Th2標記（如GATA-3、STAT6、STAT5A和IL13）均與MGP表達顯著相關。這些結果揭示了MGP在免疫調節中的作用。MGP有激活巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的潛力。MGP表 達 與KIR3DL1、KIR3DL2、CD68、CD115、IL-10、HLA-DPB1等巨噬細胞和樹突狀細胞基因標志物的表達呈正相關。這些相關性提示了MGP調控卵巢癌免疫細胞功能的潛在分子機制。

本文首次證實MGP在卵巢癌預后中具有重要作用，同時證實MGP基因高表達與患者預后差密切相關。MGP表達與卵巢癌免疫細胞浸潤水平密切相關，并調控多種免疫相關信號通路。在未來的研究中，需要進一步研究MGP在卵巢癌細胞中的功能，并對其分子機制進行深入探討。

作者貢獻聲明崔洪全數據分析，論文撰寫。張瀟藝，陳彬數據下載和整理。馮其貞論文審核和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。