高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠肥胖及減重手術模型的建立

馬媛媛 葛圣金

（復旦大學附屬中山醫院麻醉科 上海 200032）

肥胖已成為世界性公共衛生問題［1］。肥胖患者常合并2型糖尿病、脂肪肝、高血壓、阻塞性睡眠呼吸暫停、神經退行性疾病等，影響生活質量甚至預期壽命，節食、運動和藥物治療是常用的治療方法［2-3］。近年來，隨著減重代謝外科手術的發展，腹腔鏡胃袖狀切除術得到廣泛應用，約占減重手術的60%，且臨床治療效果顯著［4-6］。然而，減重手術改善肥胖及其相關疾病的分子機制還有待進一步研究。有研究通過腹腔注射戊巴比妥鈉的麻醉方式建立減重手術模型［7］，本研究通過高脂飲食喂養C57BL/6J小鼠來誘導肥胖模型；同時創新性使用吸入麻醉藥物進行動物的麻醉誘導和維持，以建立胃袖狀切除術小鼠模型，從而為研究肥胖人群及吸入麻醉藥物相關機制提供安全有效的動物模型。

資料和方法

實驗動物及分組40只3周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體重為（17.17±1.16）g，購于北京斯貝福實驗動物技術有限公司。本研究通過復旦大學附屬中山醫院動物倫理委員會審批（批準號：2020-035）。

適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將小鼠分為兩組：普通飲食（standard diet，SD）組和高脂飲食（high-fat diet，HFD）組，每組20只。普通飲食組喂養普通飼料，高脂飲食組喂養脂肪供能比為60%的高脂飲食（D12492）。SPF環境飼養，恒溫、恒濕，12 h光照-黑暗循環，自由飲水，每籠3～5只。每日觀察動物一般情況，每2周測量1次體重及空腹血糖。飼養20周，兩組各取5只小鼠進行相關檢測，其余小鼠再分為4個亞組，分別為普通飲食假手術（SD+sham）組（n=5）、普通飲食手術（SD+SG）組（n=10）、高脂飲食假手術（HFD+sham）組（n=5）、高脂飲食手術（HFD+SG）組（n=10）。

檢測指標及方法飼養20周，普通和高脂飲食組各取5只小鼠，進行葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance testing，GTT）、血脂及肝組織病理學檢測。

GTT小鼠禁食16 h，不禁水，腹腔注射葡萄糖溶液2 g/kg，注射后0、15、30、60、120 min，尾靜脈取血測定血糖值。

血清血脂水平腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，1 mL無菌注射器心尖部取血0.5～1 mL，室溫靜置1 h后離心（4℃，1 000×g，15 min），取上清液，放入-80℃冰箱保存，用于測定血脂水平。采用酶標儀比色法檢測血清總膽固醇及三酰甘油水平，操作流程遵照試劑盒說明書（南京建成生工有限公司）。

肝組織病理學腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，開腹取出肝臟，用生理鹽水沖去表面血液，放于標尺盤上拍照（生理解剖位）。取肝左葉進行油紅O染色及HE染色。

胃袖狀切除術

術前準備術前禁食12 h，自由飲水。為避免術中脫水，術前皮下注射20 mL/kg生理鹽水。

麻醉方案麻醉誘導采用3%異氟醚+氧氣（2 L/min），維持期間異氟烷揮發罐設置為2%，氧流量為1 L/min。

手術步驟參考文獻［7］。小鼠仰臥位，固定于75%乙醇消毒的35℃恒溫加熱手術臺上。備皮，碘伏消毒手術區域，鋪無菌單。劍突下沿腹正中線做1～2 cm切口，分離肌肉層，打開腹腔，注意分離過程，切勿傷及腹腔臟器。放置一個固定撐開器以充分暴露腹部視野，用兩根濕棉簽輕輕推開肝臟，暴露胃部。使用眼科鑷將胃提出腹部，仔細分離胃周疏松的結締組織以游離胃。用小型電凝刀離斷肝胃韌帶、胃脾韌帶、胃網膜右動脈，充分止血。沿著胃大彎，用動脈夾對口夾閉胃壁，從胃食管連接處5 mm到距幽門5 mm處，切掉約80%胃組織，留下與胃食管連接處與幽門連續的狹窄胃組織，清除胃內容物，碘伏消毒殘端，6-0帶線縫針間斷垂直內翻縫合切口，確認縫合，徹底止血。將胃輕輕還納腹腔并取出牽開器，充分沖洗手術部位周圍的肌肉和皮膚。使用4-0帶針縫線縫合腹膜、肌肉、皮膚，傷口局部涂抹組織膠（圖1）。殘胃縫合后密切觀察吻合口是否有液體滲出，一旦發現滲漏，再縫一層。

圖1 C57BL/6J小鼠胃袖狀切除術示意圖Fig 1 Schematic diagram of sleeve gastrectomy in C57BL/6J mice

術后護理將小鼠放置于加熱毯上，密切觀察意識狀態及呼吸，直至麻醉蘇醒。術后第1天禁食禁水，皮下注射糖鹽水20 mL/kg；術后第2～3天流質飲食；術后第4天各組恢復普通飲食；術后連續3天肌肉注射青霉素（30 000 U/kg）預防感染；術后每日觀察小鼠一般情況并及時對癥處理。術后每周稱量1次體重。

假手術假手術組所有小鼠開腹后僅進行胃組織游離，其他步驟及麻醉方式均同胃袖狀切除術組。

統計學分析用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統計學分析及作圖。符合正態分布的計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組及以上比較采用單因素方差分析，并采用LSD法進行兩兩比較；體重及血糖比較采用兩因素重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

小鼠體重變化適應性喂養1周后，普通飲食組及高脂飲食組小鼠的體重分別為（17.16±1.06）g和（17.19±1.25）g，差異無統計學意義。高脂飲食喂養4周后，高脂飲食組小鼠體重顯著高于普通飲食組（P＜0.05），并一直持續至喂養結束（圖2A）；喂養20周后，普通飲食組及高脂飲食組小鼠的體重分別為（32.23±1.73）g和（42.71±2.30）g（圖3A），高脂飲食組小鼠體重比普通飲食組增加20%以上。

圖3 普通飲食和高脂飲食小鼠及其肝臟比較Fig 3 Comparison of the mice fed by SD and HFD and their liver

高脂飲食手術組和假手術組小鼠術前體重分別為（43.82±1.76）g和（42.25±1.64）g，差異無統計學意義。高脂飲食手術組及假手術組小鼠術后第1周體重均顯著下降（P＜0.05，圖2B）；接下來3周，高脂飲食假手術組小鼠體重逐漸恢復，術后第3周已恢復至術前體重，而高脂飲食手術組小鼠術后體重持續下降；術后第4周，高脂飲食手術組小鼠體重為（35.63±1.86）g，較術前下降約20%，顯著低于假手術組［（42.68±1.95）g］（P＜0.01）。普通飲食組小鼠術后體重變化趨勢與高脂飲食組一致。

圖2 各組小鼠體重變化Fig 2 Changes of body weight of mice in different groups

血糖及葡萄糖耐量普通飲食組和高脂飲食組小鼠適應性喂養1周后基礎血糖分別為（5.61±0.86）mmol/L和（5.58±0.36）mmol/L，差異無統計學意義。喂養16、18及20周后，高脂飲食組小鼠血糖均顯著高于普通飲食組小鼠（P＜0.05，圖4A）。喂養20周后，兩組小鼠血糖分別為（6.74±0.31）mmol/L和（8.82±0.51）mmol/L。喂養20周后，高脂飲食組小鼠GTT 0、15、30、60、120 min血糖均高于普通飲食組小鼠，且AUC高于普通飲食組（P＜0.01，圖4B、4C）。

圖4 普通飲食和高脂飲食小鼠的血糖及葡萄糖耐量比較Fig 4 Blood glucose and glucose tolerance testing of the mice fed by SD and HFD

血脂水平喂養20周后，高脂飲食組小鼠血清總膽固醇顯著高于普通飲食組，分別為（4.40±0.57）mmol/L和（2.31±0.35）mmol/L（P＜0.01，t=6.24）；血清三酰甘油顯著高于普通飲食組小鼠，分別為（2.26±0.25）mmol/L和（1.11±0.24）mmol/L（P＜0.01，t=6.72）。

手術成功率及存活率各組手術均順利完成（圖5A）。假手術組小鼠存活率為100%。高脂飲食手術組小鼠存活率為70%（7/10）：術后死亡1只（麻醉未蘇醒）；術后第1天死亡1只（腹腔內出血）（圖5B）；術后第3天死亡1只（吻合口瘺及腹腔感染）（圖5C）。其余小鼠均在術后第2天恢復流質飲食；術后第4天正常飲食。普通飲食手術組小鼠存活率為80%（8/10）；術后第1天死亡1只（腹腔內出血）；術后第3天死亡1只（腹腔感染）。

圖5 高脂飲食小鼠術后情況及并發癥Fig 5 Postoperative state and complications of the mice fed by HFD

組織病理學結果高脂飲食組小鼠肝臟肉眼可見脂肪肝改變（圖3B）。肝臟組織HE染色后鏡下示：高脂飲食小鼠肝臟呈現明顯脂肪浸潤及肝細胞脂肪變性；普通飲食小鼠肝小葉結構清晰完整，肝細胞呈多邊形，細胞核圓且位于細胞中央（圖6）。肝臟組織油紅O染色后鏡下示：高脂飲食小鼠肝臟出現大片脂質沉積；普通飲食小鼠肝臟無明顯脂質沉積（圖6）。

圖6 普通飲食和高脂飲食小鼠肝臟HE染色及油紅O染色Fig 6 Representative microphotographs of HE and oil red O-stained liver section of the mice fed by SD and HFD

討 論

肥胖是一個世界性的健康問題。1990年至2015年，高體質指數已導致全球400萬人死亡［8］，預計到2025年全球肥胖患病率將在男性中達18%，在女性中超過21%［9］。眾所周知，肥胖會增加多種疾病的患病風險，包括血脂異常、2型糖尿病、高血壓及多種癌癥［8，10-12］。肥胖患者更易發生中樞神經系統疾病，如阿爾茨海默癥、中風、癡呆、抑郁癥［10，13］。

肥胖是遺傳基因和環境因素相互作用的結果。遺傳性肥胖相對罕見。環境因素可引起肥胖，如飲食類型或運動水平。嚙齒動物遺傳模型（ob/ob和db/db小鼠或Zucker大鼠）已用于肥胖的機制研究。飲食誘導的肥胖模型（diet-induced obesity，DIO）能更好地代表肥胖及相關病理生理學變化，便于進行時間相關性研究，并可用于比較不同類型飲食對肥胖的影響。嚙齒動物的飲食主要包括標準飲食、西方飲食、高糖飲食、高膽固醇飲食、高脂飲食等，其中高脂飲食是最常用的DIO飲食類型。本研究采用高脂飲食喂養20周成功建立了肥胖小鼠模型，喂養4周后開始出現差異，最終組內所有小鼠體重均比普通飲食小鼠平均體重增加20%以上，且高脂飲食組血脂水平及血糖水平均較普通飲食組顯著升高。

近年來，我國的減重手術日益增加，由2014年的4 000例增長至2019年的1萬例以上［14］。減重手術主要術式包括腹腔鏡胃袖狀切除術（laparoscopic sleeve gastrectomy，LSG）、腹腔鏡Roux-en-Y胃旁路術、膽胰轉流十二指腸轉位術。其中，LSG因術式簡單、療效好且并發癥少而被較多應用［15］。肥胖相關的基礎研究也越來越多，主要集中于代謝、能量平衡、炎癥等方面，這些都可能是減重手術治療效果的潛在機制［16-17］。一個安全有效的肥胖小鼠模型和胃袖狀切除術模型有利于減重手術治療肥胖相關疾病的機制研究，進而應用于臨床肥胖癥患者的診療。本研究在既往研究的基礎上加以創新與改進，比如麻醉方式、縫合線的選擇、術后鎮痛、術后抗感染方案等，成功建立了胃袖狀切除術的小鼠模型，存活率高且術后小鼠體重下降明顯。胃袖狀切除術為一項侵襲性手術操作，術中需要對小鼠的消化系統進行重建，主要難點在于提高圍術期存活率，主要與術后出血及腹腔感染相關。小鼠因為體型特點，手術操作空間小，手術難度進一步增加。術后出血及術后感染是小鼠死亡的主要原因，因此手術區域徹底止血及圍術期應用抗生素預防感染十分重要。高脂飲食手術組中1只小鼠麻醉未蘇醒且體溫較低，腹部手術創面大，散熱多，故圍術期保溫十分重要。

本研究不足之處在于：（1）由于建模時間長，飼養籠位有限，故樣本量較少；（2）僅在術后使用抗生素，如果手術前后均使用抗生素，可能降低術后腹腔感染，降低手術組小鼠死亡率。

高脂飲食喂養20周可誘導C57BL/6J小鼠肥胖，并成功實施胃袖狀切術。本研究為減重手術改善肥胖相關疾病的機制研究提供了一個可行且有效的模型。

作者貢獻聲明馬媛媛文獻調研和整理，數據采集和分析，論文構思、設計、撰寫和修訂。葛圣金研究構思和指導，論文指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。