一例華南虎淋巴瘤的診斷與分析

陳騰騰 傅文源，2 林錫潘 張 樂 蘭作閩，4 童 鑫 林煒明 林藝群，6 林開雄*

(1.福建梅花山華南虎繁育研究所，上杭，364201；2.龍巖市地質公園保護發展中心，龍巖，364000；3.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；4.龍巖市野生動植物保護管理站，龍巖，364000；5.龍巖學院生命科學學院，龍巖，364012；6.江西農業大學動物科學技術學院，南昌，330045)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)又名中國虎，僅分布于中國，是最古老的虎亞種，國家一級保護野生動物[1]。自2001年以來，已沒有可靠證據表明野外存在華南虎繁殖群體[2]。就現階段而言，圈養在各動物園、繁育基地的約200只華南虎[3]，將是復壯種群的唯一希望。疾病作為困擾種群發展的重要因素，往往是造成動物死亡的直接原因[4-5]，淋巴瘤就是其中之一。淋巴瘤又稱淋巴癌，一種原發于淋巴結和淋巴組織的惡性腫瘤，是一種慢性消耗性疾病。瘤細胞經淋巴血液途徑擴散，形成大小不等的結節或致密腫塊，可影響淋巴結及周圍臟器。根據血象變化，淋巴瘤可分為“白血病性淋巴瘤”和“非白血病性淋巴瘤”兩大類[6]。現在普遍認為，外源性因素和內源性因素是誘發淋巴瘤的致病原因[7]。在貓科(Felidae)動物腫瘤疾病中，淋巴瘤的發生較常見，約占貓科動物惡性腫瘤疾病的33%，并與貓科動物的白血病發生呈高度相關[8]。本研究將分析1例華南虎的淋巴瘤病例，針對該虎的發病實況和死后病理剖檢情況進行探討，旨在為華南虎的淋巴瘤診斷提供參考。

1 基本概況

患虎為成年雌性華南虎，來自福建梅花山華南虎繁育研究所，16歲，體型較瘦。其食物以雞肉塊、新鮮牛肉和新鮮野豬肉為主。參與首次繁殖前，有不定期的嘔吐史，嘔吐物為黏液及未消化的肉塊。2016年開始繁殖后，基本無嘔吐現象，2018年4月最后一次參與繁殖時，出現食幼崽情況。發病前采食量正常(4.0～5.5 kg/d)，與人親近。

2 臨床癥狀

2019年1月22日，華南虎日采食量下降，當日采食量僅為正常采食量的一半，但精神好，主動與人親近，被毛光亮順滑。自2月5日起，偶有進食，呈漸進性消瘦。鑒于此，在飼養管理上，飼養員調整了其食物結構，在投喂雞骨架、小牛肉的基礎上，增加新鮮牛肉和新鮮野豬肉。同時，將該虎放至散放區幾日，增加其活動范圍。之后1周內，該虎食欲差，甚至廢絕，精神狀態沉郁，舌苔蒼白，基本不排便，尿液呈黃色。2月26—27日，出現雙眼無神、喜臥、后肢輕微抖動等神經癥狀。獸醫于2月28日對該虎進行麻醉取樣，同時將其抬至保定籠中進行注射、輸液治療，在輸液過程中該虎死亡。

3 常規檢查及救治

對華南虎進行麻醉保定檢查，發現其體表淋巴結顯著腫大，口腔齒齦、鞏膜等可視黏膜存在黃染。整個病情發展較為迅速。基于流行病學考慮，研究人員懷疑該虎存在血液原蟲病感染，遂在其食物中添加血蟲凈藥物進行驅蟲，此時患虎偶有進食，精神尚佳。2周后，患虎呈漸進性消瘦，精神變差，舌苔蒼白，尿液顏色加深，基本不排便，以飲水中添加抗生素進行保守治療。隨后的病程中，患虎呈現雙眼無神、喜臥、后肢輕微抖動等癥狀。以4.0 mL陸眠靈、2.0 mL鹽酸氯胺酮、1.0 mL硫酸阿托品及0.5 mL鹽酸腎上腺素進行麻前給藥與麻醉，并配合抗血液原蟲治療及補液支持療法，行肌注5%三氮脒10.0 mL(1.0 g三氮脒溶于20.0 mL體積分數 0.9%的生理鹽水)，10%右旋糖酐鐵注射液(以Fe計50.0 mL：5.0 g)4.0 mL，尾靜脈滴注250.0 mL葡萄糖氯化鈉溶液及30.0 mL維生素C。整個病程持續1個多月，患虎于2019年2月底死亡。

4 剖檢工作

4.1 體表檢查

觸摸虎體尚有余溫，觀察口腔、鼻孔、耳孔、肛周等天然孔腔無污染，體表無脫毛現象，無外傷痕跡，無體表寄生蟲。可觀察到眼睛、口腔可視黏膜及舌苔黃染(圖1)。

圖1 華南虎初步檢查

4.2 皮下及腹腔檢查

皮下脂肪、胸腹腔壁出現嚴重黃染(圖2A、B)。胸腹腔中各臟器體位正常，膈膜完整，腹腔內有黃色積液，于四肢關節窩處發現黃色積液。

觀察胸腹腔臟器，可見：①肝腫大，質脆。肝臟表面及實質內布滿灰白色結節，其大小相近，觸摸堅硬有顆粒感(圖2C)。②脾腫大、質脆，切開可見布滿大小不一的灰白色結節，一側表面分布有白色點狀突起，該突起大小相近，觸摸較軟(圖2D)。③肺萎縮，表面散布灰白色結節，大小較為一致，質硬，部分肺葉表面散布黑點，肺葉邊緣組織膨大呈空泡狀(圖2E)。④腎實質表面散布灰白色結節，觸摸堅硬有顆粒感，其中腎盂有黃染(圖2F)。⑤胰腺腫大，表面布滿灰白色結節，其大小相近，觸摸堅硬有顆粒感(圖2G)。⑥膽囊外觀正常，膽汁呈正常墨綠色。⑦膀胱黃染，無尿，膀胱內壁一側散布有白色突起物，觸摸軟。⑧胃外觀黃染，胃剖開無異常。⑨胸腔內心臟結構完整，心肌、心外膜無出血。

觀察淋巴結，可見：在淺表淋巴結中(圖2H)，雙側下頜9個淋巴結腫大似雞蛋。兩側鎖骨上7個淋巴結腫大如鴨蛋。兩側腋下10個淋巴結腫大壞死，大如鴨蛋。腹股溝淋巴結腫大。在深部淋巴結中，頸淋巴結腫大，腫大程度大小不一，并有部分壞死。腸系膜淋巴結腫大，形狀不規則并有部分壞死。

圖2 華南虎剖檢結果

5 實驗室診斷

5.1 固定液的配置

配置終濃度為2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液，簡稱雙醛固定液[9]。具體配方如下：取10 g多聚甲醛溶于100 mL去離子水中，加熱至65 ℃，期間逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，緩慢搖動，待溶液澄清透明，冷卻待用。PB溶液配置，A液，取7.8 g NaH2PO4·2H2O溶于去離子水中，定容至250 mL；B液，取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于去離子水中，定容至1 000 mL。取234.5 mL A液與1 000.0 mL B液混合均勻，即為PB溶液。取上述配置的多聚甲醛溶液100 mL，加入到250 mL的PB溶液中，再添加50 mL的25%戊二醛溶液，去離子水定容至500 mL，棕色瓶中保存，備用。采用雙醛混合液的方式，可以更好地使醛分子滲入組織，加快蛋白變性凝固，以防止細胞死后發生自溶或被細胞分解，從而保持組織細胞原本的形態結構。

5.2 切片制作

切取各新鮮組織的病料塊(厚度不宜超過1 cm)放入雙醛固定液中，充分浸泡后，置于冰箱冷藏室(2～6 ℃)，24 h后即可制作切片。根據大量預試驗摸索出組織塊梯度脫水和浸蠟的最優時間(表1)。浸蠟后的組織塊置于包埋機中進行包埋蠟塊過程。切片時，切取5 μm薄片進行脫蠟、染色，染色時間需嚴格控制(表1)，以防背景顏色對最終結果產生干擾。染色后的切片以中性樹脂封片。

表1 組織塊的脫水、浸蠟和切片染色時間

5.3 光鏡下觀察

使用光學顯微鏡觀察制作好的切片，結果顯示：各組織切片中均可明顯看到瘤細胞已經嚴重侵蝕內臟器官，并散布在這些內臟器官結構中。瘤細胞呈彌漫性排列，浸潤并慢慢擠壓周邊的正常組織細胞。瘤細胞形態大小較為一致，呈圓形或卵圓形，體積小胞質少核大圓，染色呈深色。

肝臟(圖3A)：肝實質被大量淋巴細胞樣腫瘤細胞取代，形成包膜明顯的腫瘤細胞區，肝臟細胞結構破壞，淋巴細胞浸潤，肝索的結構紊亂。

脾臟(圖3B)：局部多處散在脾臟實質細胞被淋巴細胞樣腫瘤細胞取代，脾小梁萎縮，淋巴細胞浸潤，白髓紅髓間無明顯界限。

肺臟(圖3C)：支氣管黏膜層縱行皺襞逐漸消失，淋巴瘤侵入管腔，透明軟骨細胞大量壞死。肺小葉局部存在結締組織增生，肺泡隔細胞成分增多，出現大量成纖維細胞，肺泡隔增厚，并伴隨淋巴細胞浸潤。

腎臟(圖3D)：腎實質被淋巴細胞樣腫瘤細胞取代，腫瘤區腎小管等結構全部消失，零星存在的腎小球被淋巴細胞浸潤。其余未被腫瘤細胞取代的腎實質處，發生腎小管上皮細胞壞死、核溶解、消失，局部可見形成的管形；腎小球結構紊亂、萎縮，甚至消失。

胰腺(圖3E)：實質細胞被淋巴細胞樣腫瘤細胞取代。

淋巴結(圖3F)：被許多濾泡樣結構占據，這些結構由中型至大型淋巴細胞組成。這些細胞包漿稀少，細胞核圓形，染色體呈細點狀，常見明顯的核仁。偶見有絲分裂相。

圖3 華南虎組織病理變化

6 結果

剖檢結果顯示，患虎全身淋巴結均腫大壞死，肝、脾、腎、胰、肺等臟器表面均有灰白色結節。肝損傷導致機體出現嚴重的黃疸，致使全身明顯黃染。腎臟異常，使得患虎在排尿及尿液顏色方面出現問題，加之飲水少使得尿色出現濃茶色樣。肺臟萎縮，邊緣組織膨大如空泡狀，致使機體氣體交換氧合作用降低。各臟器組織功能的損傷，引起機體運轉異常，使患虎出現精神不振、不愿運動、喜臥等癥狀。僅從剖檢結果看，患虎是因機體大部分器官受到不同程度的損壞，打破機體穩態平衡，最終致死。

組織病理學檢測結果顯示，患虎各臟器都有不同程度的損壞。從切片鏡檢中均可發現淋巴細胞樣瘤細胞浸潤于各臟器組織內。在淋巴結中，正常淋巴結結構被大片形態一致的淋巴細胞樣腫瘤細胞取代，且多個器官被累及。通過觀察，研究人員還發現臟器中的腫瘤細胞與淋巴結中腫瘤細胞形態一致。瘤細胞主要以分裂細胞為主，呈淋巴樣細胞，其細胞組織形態符合細胞性惡性淋巴瘤。根據剖檢記錄和病理組織切片的觀察，最終判定為體表、腸系膜淋巴結B細胞惡性淋巴瘤，累及肝脾、肺、腎臟、胰腺等組織。由于這些器官組織的正常結構遭到破壞，嚴重影響著機體的正常運作和健康，最終導致機體死亡。

7 討論

腫瘤是虎(Pantheratigris)的多發性疾病[10]。據報道，動物園中圈養虎的腫瘤發病率高達33%，患腫瘤個體占死亡個體的69%[11]。此外，張向鵬[12]調查并統計了貴州地區3種野生動物的常見疾病，結果顯示華南虎的疾病發生率占總體發病率的44%。

虎為國家一級保護動物，屬大型猛獸，治療中不像臨床體型較小的動物易控制、好接觸，在疾病診斷方面尤為困難。短暫全麻診斷療法的麻醉風險要遠高于腫瘤風險。所以，一般情況下均采取保守治療，在食物或飲水中添加抗生素。本案例中，患虎出現食欲廢絕、精神差、喜臥而不愿運動時，考慮病情已危及生命，行全麻后扎留置針以靜脈輸液進行治療。僅根據一般臨床癥狀，還不足以用來確診病因，但如果出現持續性食欲減弱、體型消瘦、淺表淋巴結腫大等，可考慮進一步抽血化驗，從而有針對性地、全面地制定診療方案。若在癌癥早期確診，還可考慮進行藥物或手術切除以控制和緩解病情。

病理診斷是診斷腫瘤的“金標準”[13]。本研究中，患虎發病可能由多方面原因所致。由于所內未發現其他虎出現異常情況和臨床特征，基本排除了所內存在傳染性疾病因素，懷疑發病原因與患虎本身機體情況、營養狀態及免疫缺陷等有關。患虎發病前有嘔吐史，可能已顯示機體免疫力低下。初步懷疑其消化道已有一定的疾病，淋巴瘤的發生與其嘔吐既往病史是否有關，還有待進一步研究。