分子糞便學在野生動物食性研究中的應用

黃乃瑩 劉艷華

(東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

野生動物食性研究是掌握動物生境需求的核心內容，它不僅對野生動物的管理和保護有著非常重要的意義，還對理解生物多樣性如何影響生態系統的功能有著重要作用[1-2]。傳統的食性研究方法有很多種，如直接觀測法、利用法、胃容物分析法、糞便顯微分析法、籠養飼喂法等，這些方法各有利弊，一些操作可能會對野生動物資源造成破壞，不利于野生動物保護。糞便顯微分析法可以用于分析珍稀和瀕危物種的食性，但常常受到消化率、辨認率等因素的限制[3]。分子糞便學(molecular scatology)克服了傳統方法的局限性，并且可以在不接觸、不干擾野生動物生存活動的情況下，利用野生動物糞便提取DNA，用PCR擴增技術得到足夠的遺傳信息進行食性研究，可以對理解野生動物的食性和取食行為，以及進行野生動物種群保護、資源管理、棲息地評價等研究提供基礎資料和理論依據。本研究旨在介紹分子糞便學在食性研究上的幾種主要方法，同時闡述國內外分子糞便學食性研究的進展和發展趨勢，以期為今后研究者們提供借鑒，促進該技術更好地應用與發展。

1 糞便DNA的研究方法

1.1 采集、保存與運輸

采集新鮮的糞便樣本更有利于提取DNA，所以在取樣之前要進行詳細的試驗設計。冬季氣溫低，地面被雪覆蓋，有利于追蹤野生動物的足跡，更容易收集到新鮮的糞便樣本。采集時需佩戴一次性PE手套，每次采集均需要更換手套避免交叉污染。不同糞堆分裝并記錄地理信息、時間、天氣、該區域植物組成等信息。如果研究食草動物，還需建立樣方，采集食草動物可取食范圍內的所有植物，補充植物數據庫信息。糞便樣本的保存要避免DNA降解和方便運輸，主要保存方法有：硅膠干燥法[4]、乙醇保存法[5]和冷凍保存法[6]。乙醇保存法多用體積分數95%的乙醇或無水乙醇；冷凍保存法溫度一般為-20 ℃或-80 ℃。運輸過程中保持0 ℃以下。也可根據實際需要，綜合使用不同保存方法，保證野外保存的可行性和運輸的便利性。

1.2 DNA提取

目前，大多利用試劑盒提取糞便DNA，其中QIAamp DNA Stool Mini Kit使用最多，但是此試劑盒中含有馬鈴薯吸附劑，在進行食性分析時會造成不必要的誤差[7]。分析食草動物食性時避免采用上述試劑盒，可以使用Zymo ZR Fecal DNA MiniPrep Kit[8]、Maxwell?16 Tissue DNA Purification Kit[9]等。除了試劑盒法，CTAB提取法對利用糞便提取DNA進行食性分析的效果也很好[10]。改進后的2CTAB-PCL法則更適合食肉動物糞便DNA的提取[11]。

1.3 序列選擇

生命條形碼聯盟(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)建議將葉綠體基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼。rbcL片段在物種水平變異小，更為通用。matK、trnH-psbA片段進化速率快，通用性差，適合種屬水平的物種鑒別。ITS在物種水平上變異較大，應用廣泛[12]。還有學者提出了其他片段與片段的組合，需結合具體情況進行分析。

2 分子食性分析方法

2.1 DNA條形碼(DNA barcoding)

DNA條形碼是利用一段標準化的DNA序列作為標簽，以快速、準確地進行物種鑒定。“DNA barcoding”一詞最早在1993年被使用[13]，但在2003年Hebert等[14-15]的論文發表后才得到重視。Hebert等提出利用線粒體基因細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ的基因片段可以作為全球動物生物鑒定系統的核心，并且從門、目、種等分類水平上進行試驗和分析，證明其具有良好的識別能力。將其中一段長約650 bp的DNA序列作為動物的標準DNA條形碼，得到廣泛認可和應用。此后，植物學研究中也使用了DNA條形碼，使從糞便中分離出的DNA確定食草動物的飲食結構成為可能。

當然，DNA條形碼技術也存在一定缺陷。首先，理想的DNA條形碼標記應該是可變的、標準化的、系統發育信息豐富的、極其穩定和短小的，然而這樣一個理想的DNA條形碼還沒有被發現。其次，由于DNA條形碼上的遺傳信息有限，且DNA條形碼的原理是利用種內特異性和種間變異性來完成物種鑒定，在利用動物糞便進行食性分析時，往往會因為動物取食近緣植物而導致分析存在偏差。再次，DNA條形碼技術也常因價格昂貴而不被研究人員選擇。

2.2 DNA宏條形碼(DNA metabarcoding)

二代測序技術(next-generation-sequencing，NGS)的發展，克服了Sanger測序法不能對多種不同個體和物種混合樣品進行快速有效分類、評估的問題。DNA宏條形碼技術就是在此基礎上產生的，主要是利用高通量測序技術大量獲得混合樣本中多種條形碼基因擴增子序列，并通過生物信息學手段分析鑒定[16]。此方法可利用混合樣本自動識別出多個物種，提高了食性分析的分辨率和物種鑒定水平，大大減少了采樣的工作量[17]。

2.3 DNA微型條形碼(DNA mini-barcoding)

陳舊樣本或經過其他處理的DNA降解樣本，很難擴增出完整的DNA條形碼，DNA微型條形碼則解決了這一問題。DNA微型條形碼是在DNA條形碼的基礎上進行的補充和完善，它與傳統DNA條形碼相比較短，一般為長度100～200 bp的DNA序列，在易降解的DNA樣本中也可以獲得[18]。

3 分子糞便學的應用

Taberlet等[19]在2007年提出利用葉綠體trnL(UAA)內含子，特別是其P6環，來研究食草動物的食性。由于其引物高度保守，擴增系統非常穩定可廣泛應用到基于糞便的食性分析。目前，DNA條形碼技術已經成功地從食草動物的糞便中識別出各種食草動物的食性偏好。例如，Buglione等[20]從22份糞便樣本中利用CTAB法提取糞便DNA，并采用DNA條形碼(植物ITS1區域)和二代測序技術成功地分析了科西嘉島野兔(Lepuscorsicanus)的食性，用同種方法比較了當地競爭種——歐洲野兔(L.europaeus)的食性，有效地評估了科西嘉島野兔和歐洲野兔的競爭關系，為了解當地瀕危物種的食性組成、了解其在生物群落中的作用提供了關鍵資料；Kowalczyk等[21]在2012年利用植物條形碼trnL區域對歐洲野牛(Bisonbonasus)的食性進行了準確分析，為當地野生動物保護和森林管理提供了基礎數據；Baamrane等[22]在春、夏、秋3個季節共采集糞便樣本60份，利用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒進行糞便DNA的提取，用植物條形碼trnL對鹿瞪羚摩洛哥亞種(Gazelladorcasmassaesyla)的食性做出了準確評估。Erickson等[8]在對白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的食性研究中利用了植物rbcL基因的微型條形碼，準確率接近全長DNA條形碼的90%，顯示出了較高的物種鑒定水平，但也需要更多對比試驗來驗證結果的可靠性。邵昕寧等[5]在利用宏條形碼技術從不同糞便樣本中成功分析出了7種食肉動物的食性組成，其中包括豹貓(Prionailurusbengalensis)、赤狐(Vulpesvulpes)、狼(Canislupus)、狗(Canislupusfamiliaris)、棕熊(Ursusarctos)、豹(Pantherapardus)和雪豹(P.unica)。上述研究不僅對了解動物食性有巨大幫助，還有助于了解研究地區的生態系統食物網結構及功能，這對于生物多樣性保護有重要意義，同時也為使用糞便DNA進行食性分析提供了有利借鑒。

4 結論與討論

隨著技術方法的不斷革新和條形碼數據庫的豐富，分子生物學在食性研究領域的關注度持續上升。但國內關注時間較短，發文量較少，利用糞便作為研究樣本的文獻更是寥寥無幾[23]。在國內，DNA條形碼在魚類和昆蟲上應用較多，在食性分析、構建食物網結構上有很好的表現，但樣本均為胃容物[24]。目前，國內對野生動物的食性研究大多仍選擇糞便顯微分析法，但分子糞便學在食性研究中比傳統方法更為準確和客觀。分子糞便學研究野生動物食性常受到樣本質量的制約，但是隨著測序技術的不斷發展，這種問題也在逐步解決。Mini-DNA條形碼的提出在一定程度上對條形碼技術進行了完善和補充，因為它與DNA條形碼相比需要的序列更短，更容易從已降解的糞便樣本中得到。在高通測序技術上產生的DNA宏條形碼技術解決了另一問題，即對多種不同個體和物種混合樣品進行快速有效分類以及評估。注重糞便樣本的采集與保存、對糞便樣本重復提取等也可以提高結果的準確率。也可結合試驗地點的植被情況，選擇植物條形碼序列，建立當地植物DNA條形碼數據庫，設計特異性引物對近緣種植物進行區分[7]。

可以預見，未來會更注重大規模多重引物PCR技術的應用，因為多重PCR技術不僅可以擴增出同一模板不同區域的多個目的DNA片段，還可以同時擴增出多個DNA模板的不同DNA片段，達到節約樣品、減少試驗次數、降低試驗污染的目的，同時節約了時間和經濟成本[25-26]。由于非損傷性取樣的獨特優點以及分子生物學技術的快速發展，未來野生動物的食性分析中分子糞便學將占據極大優勢。分子糞便學在食草動物的食性鑒定中有巨大潛力，如果找到準確區分牧草類型的標準植物條形碼，不僅對野生動物夏季食性研究帶來巨大幫助，還可以通過檢測放牧動物的食性數據來預估動物產能，從而獲得更大的經濟收益[27]。這不僅是一個用于森林及其養護管理的有效工具，還是一種加強生態研究、重點關注食草動物對生態系統的影響及其可能的食物生態位重疊的方式，還可以監測城市周邊小型野生動物對城市周邊生態系統的影響[28]。總之，分子糞便學技術前景廣闊，隨著技術水平的不斷提高，此方法將會越來越準確高效，并能更好地應用到野生動物的食性分析中。