代謝組學(xué)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷和治療中的研究進(jìn)展

呂蒙瑩，梁巧玲，羅照勇，倪騰洋，劉延慶

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室，江蘇 揚(yáng)州 225001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性自身免疫性疾病，其基本病理特征為滑膜襯里層增生和炎性細(xì)胞浸潤(即滑膜炎)[1]。與健康人群相比，RA患者增生的滑膜細(xì)胞會(huì)與新生微血管形成滑膜血管翳，向關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)侵襲性生長，形成血管翳/軟骨結(jié)合，這一結(jié)構(gòu)是造成RA病人關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)畸形，功能障礙的病理基礎(chǔ)。RA發(fā)病率約為0.5%～1.0%，任何年齡段均可發(fā)病，多見于35～50歲成年人[2]，由于致殘率高且無法完全治愈，給患者及其家庭帶來了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。早診斷、早治療對(duì)于預(yù)防該疾病進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要，越來越多的學(xué)者將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于RA的早期診斷、藥物療效預(yù)測與評(píng)價(jià)研究中，現(xiàn)就其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 RA代謝組學(xué)研究概述

代謝組學(xué)(metabolomics/metabonomics)這一概念最初是在20世紀(jì)末由Nicholson等[3]提出，是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后迅速發(fā)展起來的一門新興組學(xué)(-omics)學(xué)科,它利用現(xiàn)代分析技術(shù)，定量研究生物體在不同狀態(tài)下(如給藥前后)，所含內(nèi)源性小分子代謝物(一般指MW<1 000)種類、數(shù)量變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律。代謝組學(xué)的研究對(duì)象是生物體內(nèi)參與物質(zhì)代謝、能量傳遞和信息傳導(dǎo)的全體小分子物質(zhì)即代謝組(metabolome)，因此其研究步驟主要包括生物樣品預(yù)處理(代謝物提取)、數(shù)據(jù)采集(代謝物檢測)和數(shù)據(jù)分析(差異代謝物發(fā)現(xiàn))3個(gè)部分[4]。

Li等[5]通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)在RA代謝組學(xué)研究中，常選用RA患者血清、尿液和滑膜液，雖然滑膜液比血液和尿液更能反映其關(guān)節(jié)的病理變化，但滑膜液只能從有關(guān)節(jié)液溢出的RA或骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者中獲得，很難從相對(duì)應(yīng)的健康人群中獲取。同樣，關(guān)節(jié)組織(例如軟骨和骨)樣本也很難從人體中大量獲取。代謝物檢測主要依賴于核磁共振共振技術(shù)(1H-,13C-NMR)和基于質(zhì)譜的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)和質(zhì)譜成像技術(shù)(MSI)的快速發(fā)展[6]。質(zhì)譜的主要優(yōu)勢在于對(duì)代謝物的高靈敏度和高覆蓋率快速分析，并且可與多種色譜技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)代謝物的有效分離，而NMR在非破壞性、重復(fù)性、定量和結(jié)構(gòu)鑒定等方面具有不可比擬的優(yōu)勢，因此越來越多的代謝組學(xué)研究開始將多種分析技術(shù)聯(lián)合使用從而極大的拓展了代謝物的檢測范圍，也使檢測結(jié)果可以相互印證[7]。代謝物檢測獲得的大量數(shù)據(jù)需要經(jīng)過預(yù)處理和多元統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)預(yù)處理的目的在于將原始圖譜轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)矩陣并消除或降低實(shí)驗(yàn)操作和儀器分析過程中的誤差，一般分為峰識(shí)別、峰匹配與對(duì)齊、歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化等步驟，其中NMR數(shù)據(jù)還需要進(jìn)行峰積分或分段積分。模式識(shí)別是代謝組學(xué)研究中常用的多變量分析方法，如主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，目前多種軟件或程序語言如SIMCA-P、Unscrambler、Matlab、R等均可實(shí)現(xiàn)多變量分析。代謝通路分析可借助人類代謝組HMDB數(shù)據(jù)庫、代謝通路數(shù)據(jù)庫(Biocyc)和基于網(wǎng)絡(luò)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理一體化軟件MetaboAnalyst[4]。

2 代謝組學(xué)在RA診斷中的應(yīng)用

代謝組學(xué)的檢測對(duì)象是脂質(zhì)、糖類、氨基酸、有機(jī)酸和核酸等內(nèi)源性小分子代謝物，作為生物體內(nèi)一系列生化反應(yīng)的終產(chǎn)物，能夠綜合反映機(jī)體在多種因素(如基因，飲食，生活方式等)作用下受疾病侵襲的影響。RA早期臨床癥狀與其他類型關(guān)節(jié)炎難以區(qū)分，而作為一種自身免疫性疾病，早期診斷和治療能有效防止病情惡化，因此發(fā)現(xiàn)特異性強(qiáng)、靈敏度高的RA診斷標(biāo)志物至關(guān)重要。

2.1 RA診斷生物標(biāo)志物Tab 1匯總了代謝組學(xué)在RA診斷標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的應(yīng)用。Surowiec等[8]收集了瑞典北部生物庫中RA患者發(fā)病前捐獻(xiàn)的血漿樣本，發(fā)現(xiàn)RA患者確診前血漿中溶血磷脂酰膽堿(LPCs)、色氨酸相關(guān)代謝物以及大部分磷脂和鞘磷脂水平顯著升高。在一項(xiàng)大規(guī)模(132名RA患者，104名健康者)RA代謝組學(xué)研究中，Yousri等[9]測定了血漿中927個(gè)代謝物,發(fā)現(xiàn)其中32個(gè)代謝物與RA相關(guān)，包含了之前報(bào)道過的硫酸脫氫異雄甾酮(DHEAS)，皮質(zhì)醇和雄烯二酮等甾體類代謝物，并且發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)類固醇的治療能夠引起這些甾體類代謝物水平的變化。OA和RA是關(guān)節(jié)炎中最常見的兩種形式，雖然都與年齡相關(guān)，但發(fā)病機(jī)理完全不同，Anderson等[10]發(fā)現(xiàn)與OA患者相比，RA患者滑膜液中糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物含量較低，這與RA患者炎癥反應(yīng)、滑膜增生和缺氧癥狀更嚴(yán)重的情況相吻合，而OA患者滑膜液中牛磺酸含量較高可能與軟骨下骨硬化有關(guān)。Dubey等[11]采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)分析RA與反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(ReA)患者血清樣本發(fā)現(xiàn)，纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸/精氨酸和苯丙氨酸這四組代謝物可作為區(qū)分RA與ReA的生物標(biāo)志物。干燥綜合癥(sjogren’s syndrome,pSS)和RA均為自身免疫性疾病，Li等[13]發(fā)現(xiàn)與pSS患者和健康人群相比，3個(gè)代謝物(4-甲氧基苯基乙酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸)可以作為RA的特異性標(biāo)志物，ROC曲線分析表明這組代謝物的靈敏度為93.30%，特異性為95.2%。

Tab 1 Application of metabolomics in biomarker discovery for RA diagnosis

2.2 區(qū)分中醫(yī)寒、熱證RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，在中醫(yī)證候研究中，多將RA分為寒證(寒濕痹阻證)和熱證(濕熱痹阻證)進(jìn)行辨證論治。Gu等[14]采用基于LC-MS和GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)57例RA患者和23例健康者的血漿標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RA患者磷酸肌醇、脂質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、抗壞血酸、乙醛酸和二羧酸酯代謝異常，進(jìn)一步將RA患者分為寒證和熱證后發(fā)現(xiàn)，RA熱證患者血漿中甘氨鵝脫氧膽酸鈉、脯氨酸、飽和及單不飽和磷脂酰膽堿濃度高于RA寒證患者，而尿素、游離脂肪酸和多不飽和磷脂酰膽堿含量低于RA寒證患者。Herman等[15]對(duì)39例RA患者進(jìn)行尿液和血漿代謝組學(xué)分析及癥狀譜分型，發(fā)現(xiàn)寒熱證型RA患者的C-反應(yīng)蛋白和類風(fēng)濕因子水平相同，但“關(guān)節(jié)紅腫”、“關(guān)節(jié)腫脹”等臨床癥狀顯示兩組患者的炎癥水平存在差異，尿液代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，RA熱證患者的11種酰基肉毒堿水平均高于RA寒證患者，說明寒熱證患者可能在肌肉分解水平上存在差異，RA寒證患者的DHEAS水平相對(duì)較低，說明RA寒證患者的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能可能受到抑制。Guo等[16]利用基于LC-MS和GC/MS的代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)具有典型中醫(yī)寒熱證候的RA患者血漿代謝譜進(jìn)行了分析，結(jié)果表明與健康對(duì)照組相比，寒、熱證RA均會(huì)引起氨基酸、碳水化合物和脂質(zhì)代謝物水平的變化，但寒證RA患者具有蛋白質(zhì)和膠原分解紊亂、糖酵解和有氧氧化降低以及能量代謝加快等特點(diǎn)，可以用于RA寒熱證的區(qū)分。

3 代謝組學(xué)在RA治療中的應(yīng)用

3.1 預(yù)測藥物治療效果TNF抑制劑是RA治療中常用的生物改善病情抗風(fēng)濕藥物(biological disease-modifying antirheumatic drugs，bDMARDs)，但仍有1/3的患者對(duì)TNF抑制劑治療無效或療效較差，鑒于治療效果的不確定性以及該類藥物昂貴的價(jià)格，對(duì)TNF抑制劑治療效果的早期預(yù)測至關(guān)重要，越來越多的組學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于TNF抑制劑RA療效預(yù)測生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)[17]。Priori等[18]采用1H-NMR技術(shù)測定了27位女性RA患者在采用依那西普Etanercept治療前及治療6個(gè)月后的血清代謝輪廓譜。根據(jù)EULAR(European League Against Rheumatism)標(biāo)準(zhǔn)將患者按臨床治療效果分為療效良好、基本有效和無效3組，發(fā)現(xiàn)治療前的血清代謝輪廓譜可以區(qū)分這三類患者,并且療效良好患者血清中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和葡萄糖水平在治療后顯著升高，而3-羥基丁酸酯水平顯著降低。Sweeney等[19]采用1H-NMR和UPLC-MS/MS技術(shù)測定了23位RA患者在原有甲氨蝶呤治療基礎(chǔ)上加入利妥昔單抗Rituximab治療前后的血清代謝輪廓譜，將患者根據(jù)6個(gè)月后的治療效果分為治療有效者和治療無效者后發(fā)現(xiàn)治療有效者在治療前血清中7個(gè)極性代謝物和15個(gè)脂質(zhì)代謝物含量與治療無效者相比具有顯著性差異。Dudka等[20]同時(shí)采用了1H-NMR,LC-MS和GC-MS技術(shù)測定了25位RA患者在采用bDMARDs治療前以及治療3個(gè)月后的血漿代謝輪廓，并記錄了治療前及治療3、6、12、18個(gè)月后的視覺模擬評(píng)分，28處關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(DAS 28)和血沉。治療方案包括甲氨蝶呤和3種TNF-α抑制劑(阿達(dá)木單抗、依那西普、賽妥珠單抗)或IL-6的單克隆抗體托珠單抗。患者根據(jù)治療效果分為治療有效者和治療無效者。對(duì)有療效者的劃分是根據(jù)EULAR標(biāo)準(zhǔn)，要求DAS28得分在治療后至少下降1.2并且得分低于3.2。代謝組學(xué)研究結(jié)果表明，治療有效者血漿中24個(gè)代謝物在治療后發(fā)生了顯著變化，涉及氨基酸、多肽、脂質(zhì)、維生素等，并發(fā)現(xiàn)有療效和無療效者血漿中11個(gè)代謝物含量在治療前具有顯著差異，其中N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神經(jīng)氨酸在治療后3個(gè)月仍具有顯著性差異，進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果表明這兩個(gè)代謝物是預(yù)測bDMARDs治療效果的潛在生物標(biāo)志物。

3.2 探索藥物作用機(jī)制雷公藤多苷片作為RA治療中常用的中成藥，在臨床治療方案中常與甲氨蝶呤聯(lián)合使用，但其共同作用機(jī)制仍不清楚，Wang等[21]對(duì)來自中日友好醫(yī)院的44名RA患者進(jìn)行為期12周的甲氨蝶呤和雷公藤多苷片單用或聯(lián)用治療，發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片與甲氨蝶呤療效相當(dāng)，但單用組均沒有聯(lián)合治療組效果好，進(jìn)一步采用定量血漿藥物化學(xué)和擬靶向代謝作學(xué)方法對(duì)血漿中7個(gè)甲氨蝶呤代謝物、13個(gè)雷公藤多苷片主要活性成分和19個(gè)內(nèi)源性差異代謝物進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明雷公藤多苷片與甲氨蝶呤聯(lián)合治療既沒有增加甲氨蝶呤代謝物引起的藥物毒性，也沒有影響雷公藤多苷片主要活性成分的吸收，并且能夠使RA引起的體內(nèi)代謝物水平變化恢復(fù)正常。為了驗(yàn)證痹祺膠囊的臨床有效性、安全性和作用機(jī)制，Wang等[22]將70位RA患者隨機(jī)分為兩組進(jìn)行為期24周的治療，一組為痹祺膠囊與甲氨蝶呤聯(lián)用，一組為來氟米特與甲氨蝶呤聯(lián)用，并記錄不同階段的治療效果，發(fā)現(xiàn)兩者并無顯著性差異，并且痹祺膠囊組的副反應(yīng)明顯低于來氟米特組。通過對(duì)血清和尿液樣本的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)痹祺膠囊治療有效的患者尿液中脂肪酸含量豐富而酰基肉毒堿含量降低，表明痹祺膠囊可以使RA患者能量代謝恢復(fù)平衡。為探究臨床常用中成藥祖師麻片的作用機(jī)制，Shan等[23]采用膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型，同時(shí)選取血清和糞便樣本進(jìn)行基于GC-MS的代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CIA模型組大鼠的血清中31個(gè)代謝物，糞便中30個(gè)代謝物發(fā)生了顯著變化，涉及三羧酸循環(huán)、糖酵解、脂肪酸和嘌呤代謝，而服用祖師麻片可以使大部分代謝物含量向?qū)φ战M水平方向變化。進(jìn)一步對(duì)糞便中的短鏈脂肪酸進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)祖師麻片可以調(diào)節(jié)CIA大鼠糞便中丙酸、丁酸和戊酸的水平。清絡(luò)飲是治療RA熱癥的常用中藥，Zuo等[24]聯(lián)合采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)清絡(luò)飲不僅能減輕CIA大鼠的癥狀，防止關(guān)節(jié)破壞，還能降低甲氨蝶呤引起的肝損傷和骨髓抑制，這可能與清絡(luò)飲能夠引起CIA大鼠體內(nèi)嘌呤、嘧啶和戊糖磷酸代謝的變化有關(guān)。

4 結(jié)論與展望

目前代謝組學(xué)主要應(yīng)用于RA的早期診斷、發(fā)病機(jī)制和藥物療效預(yù)測與評(píng)價(jià)等領(lǐng)域，涉及細(xì)胞、動(dòng)物和臨床生物樣本，其未來主要發(fā)展趨勢包括：(1)生物標(biāo)志物的驗(yàn)證：雖然RA代謝組學(xué)研究已經(jīng)積累了豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但目前仍缺乏對(duì)發(fā)現(xiàn)的差異代謝物采用不同批次生物樣本進(jìn)行含量的確證以及采用不同方法進(jìn)行分析結(jié)果的驗(yàn)證；(2)靶向性和擬靶向性代謝組學(xué)分析：在非靶向性代謝組學(xué)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對(duì)某一類型的代謝物如脂類(脂質(zhì)代謝組學(xué))或某一特定代謝通路，參考FDA生物樣品分析的方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則，建立定量分析方法；(3)與其他組學(xué)數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析：作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析將為RA診斷和治療生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供新的思路和方法。目前RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要針對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)的癥狀，無法在早期區(qū)分不同類型的關(guān)節(jié)炎性疾病，研究表明早期介入可有效延緩RA進(jìn)展，因此患者發(fā)病前的臨床樣本同樣具有重要研究價(jià)值。雖然近年來大量生物制劑應(yīng)用于RA臨床治療，但昂貴的治療費(fèi)用以及治療效果的不確定性，常常使患者望而卻步，因此，與基因組學(xué)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)能夠預(yù)測抗RA生物制劑療效的代謝標(biāo)志物意義重大。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展以及代謝組學(xué)分析流程的日益規(guī)范化，RA代謝組學(xué)研究將為RA的診斷和治療提供重要參考價(jià)值。