一種含有異氰酸酯功能基團(tuán)單體的生物安全性初步研究

楊振宇 段龍彥 周唯 高婧 方明 陳吉華

自1955 年Buenocore報(bào)道可以在酸蝕處理后的釉質(zhì)表面使用含丙烯酸酯基團(tuán)的樹脂材料進(jìn)行粘接以來(lái)[1]，樹脂粘接修復(fù)技術(shù)便成為牙體組織保存修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)[2]。為進(jìn)一步提高粘接耐久性的研究中，外源性粘接劑和牙體組織之間的額外化學(xué)結(jié)合提供了新思路[3]。本課題組近年來(lái)選用IPDI和HEMA為原料，成功合成出含有-NCO功能基團(tuán)的可聚合樹脂單體(異氰酸酯-氨基甲酸-甲基丙烯酸酯單體，isocyanate-terminated urethane methacrylate prepolymer， UMP)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合課題組前期研究,旨在解決反應(yīng)產(chǎn)物摻雜無(wú)關(guān)化合物較多這一問(wèn)題，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并初步評(píng)價(jià)該單體的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)(北京百靈威科技有限公司)；甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；雙酚A雙甲基丙烯酸縮水甘油酯(Bis-GMA)、雙酚A乙氧基化二甲基丙烯酸酯(Bis-EMA)、二甲基丙烯酸氨基甲酸乙酯(UDMA)、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(MilliporeSigma，美國(guó))；CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；α-MEM培養(yǎng)基(HyCLone，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))。

1.2 主要儀器

MS-H-PRO+數(shù)控加熱型磁力攪拌器(SCILOGEX，美國(guó))；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司，日本)。

1.3 合成路線

見(jiàn)圖 1。

圖 1 目的物合成路線

1.4 合成步驟

氮?dú)鈿夥障拢谘b有溫度計(jì)和攪拌磁子的圓底燒瓶里依次加入IPDI 20.0 g(89.97 mmol)、10滴催化劑(DBTBL-丙酮溶液，體積比1∶20)和200 mL無(wú)水丙酮在40 ℃恒溫油浴鍋中攪拌反應(yīng)20 min后，滴加11.7 g(89.97 mmol)HEMA，檢測(cè)反應(yīng)完全后停止。

待冷卻至室溫，硅膠制樣，柱色譜分離純化(PE/EA=5/1， v/v),溶劑旋蒸得到無(wú)色油狀物(10 g)。

1.5 純度測(cè)試和結(jié)構(gòu)表征

運(yùn)用高效液相色譜儀對(duì)UMP的純度進(jìn)行測(cè)試，用干燥丙酮將UMP稀釋至5 ppm，在室溫條件下，吸收波長(zhǎng)為254 nm下進(jìn)行純度檢測(cè)。

使用核磁共振波譜儀對(duì)UMP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。以500 μL d-DMSO-d6為溶劑，加入20 mg UMP。待檢測(cè)液清晰透明后，在400 MHz條件下進(jìn)行氫譜(1HNMR)檢測(cè)。

1.6 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[5-6]

將Bis-GMA、Bis-EMA、TEGDMA、UDMA以及UMP分別與含雙抗的α-MEM制備濃度梯度20、40、60、80、100、120、140、160 以及180 μg/mL的單體培養(yǎng)液。將第五代人牙髓干細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度接種到96 孔板上，每孔加入200 μL α-MEM培養(yǎng)基(含20% FBS， 100 U/mL青霉素G， 50 mg/mL抗壞血酸)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后，更換為上述單體配制成的不同濃度的單體培養(yǎng)液，普通培養(yǎng)基組記作空白對(duì)照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8，再24 h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.7 急性溶血試驗(yàn)[7]

用注射器抽取日本大耳白兔血液，制備稀釋抗凝兔全血并稀釋。將1 mg UMP加入10 mL生理鹽水記為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組為10 mL生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組為10 mL蒸餾水，各組制備3 個(gè)平行樣。在上述各組均加入稀釋抗凝兔全血0.2 mL，孵育并離心后檢測(cè)于545 nm處吸光度值，計(jì)算溶血率。溶血率大于5%方可表明單體具有溶血作用。

1.8 短期全身毒性試驗(yàn)[8]

將30 只6 周齡Balb/c小鼠(體重15～18 g，雌雄各半)隨機(jī)均分為3 組。灌胃前禁食4 h。分別使用UMP(溶于玉米油)、玉米油、Bis-GMA(溶于玉米油)作為藥物，其中UMP和Bis-GMA按照與小鼠體重120 mg/kg的比例進(jìn)行配制。 3 組均按照藥品與小鼠體重比例4 μL/g對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，分別記作實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組A、對(duì)照組B。灌胃后如前正常喂養(yǎng)，每天定時(shí)觀察臨床特征，記錄體重。 7 d后過(guò)量麻醉處死,取心臟、腎臟、肝臟等，石蠟包埋，組織切片，HE染色。

1.9 口腔黏膜刺激試驗(yàn)[9]

取4 只6 周齡SD大鼠，雌雄各半。將大鼠麻醉后口腔黏膜消毒。用直徑10 mm的棉球浸濕20 mg UMP，縫在大鼠左側(cè)頰囊，同樣10 mm棉球浸濕生理鹽水后縫合固定在大鼠右側(cè)頰囊。如前正常喂養(yǎng)7 d后過(guò)量麻醉處死大鼠，取頰囊處口腔黏膜，石蠟包埋，組織切片，HE染色。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)ISO 10993和中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)量表進(jìn)行分析評(píng)估。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0單因素分析, α=0.05。

2.1 純度測(cè)試

如圖 2所示，HPLC譜圖顯示在吸收波長(zhǎng)為254nm時(shí)UMP濃度為95.322%，保留時(shí)間為3.514 min。

圖 2 UMP的HPLC譜圖

2.2 核磁共振圖譜表征

見(jiàn)圖 3。

圖 3 UMP的 1H-NMR譜圖(DMSO-d6)

2.3 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

單體的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖 4，隨著單體濃度增大，各組細(xì)胞活性均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。相比較而言，UDMA與UMP的細(xì)胞毒性相似，半抑制濃度(LC50)位于140 μg/mL； Bis-GMA的細(xì)胞毒性最大，TEGDMA的毒性最低。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度/陰性對(duì)照組平均吸光度的公式計(jì)算，RGR數(shù)值大于75%，細(xì)胞毒性為I級(jí)。表明UMP單體細(xì)胞毒性良好。

圖 4 不同樹脂單體的細(xì)胞毒性

2.4 急性溶血試驗(yàn)

根據(jù)表 1中測(cè)得的吸光度值，按照溶血率=(試驗(yàn)組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照組吸光度-陰性對(duì)照組吸光度)×100%，計(jì)算得UMP單體在兔血中溶血率為3.6%(<5%)，表明UMP單體無(wú)急性溶血作用。

表 1 各組溶血實(shí)驗(yàn)吸光度數(shù)值

2.5 短期全身毒性試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)7 d的觀察， 3 組試驗(yàn)動(dòng)物未見(jiàn)運(yùn)動(dòng)功能減退、呼吸困難、震顫現(xiàn)象等其它臨床中毒特征，無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。處死動(dòng)物后取出心、腎、肝肉眼觀察均未見(jiàn)明顯異常。組織切片觀察如圖 5， 實(shí)驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組相比較未見(jiàn)明顯異常。

圖 5 心臟、腎、肝組織學(xué)觀察(HE, ×200)

連續(xù)7 d記錄小鼠體重，取每組小鼠體重平均值數(shù)據(jù)如圖 6，雌雄分別記錄。由圖 6可得三組小鼠體重均隨觀察時(shí)間逐漸增長(zhǎng)， 雄性小鼠體重增加普遍快于雌性小鼠。分析趨勢(shì)線斜率可見(jiàn)三組小鼠體重增速大致相同，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增速略快于兩個(gè)對(duì)照組。由組織學(xué)觀察和體重變化可得，UMP單體對(duì)小鼠未見(jiàn)短期全身毒性作用。

圖 6 小鼠7 d內(nèi)體重變化

2.6 口腔黏膜刺激試驗(yàn)

7 d觀察期內(nèi)，含藥物棉球與黏膜貼合緊密，無(wú)脫落。肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見(jiàn)頰囊黏膜有潰瘍、糜爛、紅腫等變化。組織學(xué)觀察如圖 7，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組黏膜切片情況相似，上皮和結(jié)締組織正常，無(wú)異常角化、未見(jiàn)棘層異常改變等其它異常病理性變化。表明UMP單體對(duì)大鼠口腔黏膜無(wú)明顯刺激作用。

3 討 論

如何改善牙本質(zhì)粘接的效果一直是口腔修復(fù)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。膠原是牙本質(zhì)粘接界面中含量較高的粘接介質(zhì)[10]，現(xiàn)有的粘接樹脂單體與膠原纖維之間幾乎不存在任何化學(xué)結(jié)合，而單體的單純物理滲透無(wú)法將粘接界面的牙源性成分和外源性樹脂有機(jī)整合[11-13]。因此，在粘接劑中加入可以和牙本質(zhì)膠原形成化學(xué)結(jié)合的功能成分，理論上可以引入額外的化學(xué)粘接力來(lái)改善牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度及穩(wěn)定性[14]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，將UMP純度提升到95%以上，這為對(duì)UMP的進(jìn)一步研究、利用提供了良好的基礎(chǔ)和極大的便利。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行生物安全性研究， 為其將來(lái)的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)中研究對(duì)象Bis-GMA、Bis-EMA等[15]都是作為粘接單體已在臨床廣泛應(yīng)用，因此以此作為對(duì)照，有較強(qiáng)說(shuō)服力。結(jié)果顯示UMP與UDMA細(xì)胞毒性相似，優(yōu)于Bis-GMA，半抑制濃度LC50位于140～160 μg/mL之間?？梢哉J(rèn)為實(shí)驗(yàn)單體對(duì)人牙髓干細(xì)胞無(wú)顯著細(xì)胞毒性。

短期全身毒性試驗(yàn)表明灌胃后對(duì)小鼠未造成不良影響，可以證明實(shí)驗(yàn)單體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)短期全身毒性作用。口腔黏膜刺激試驗(yàn)經(jīng)肉眼和組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)顯著差異。表明實(shí)驗(yàn)單體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物口腔黏膜組織無(wú)顯著刺激性反應(yīng)，可應(yīng)用于口腔環(huán)境。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)單體在兔血中溶血率為3.6%，符合國(guó)標(biāo)規(guī)定不大于5%的要求，表明實(shí)驗(yàn)單體無(wú)急性溶血作用。

綜上所述，分析上述四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明本課題組制備的UMP單體有良好的生物安全性，為其進(jìn)一步的性能研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本課題組將進(jìn)一步對(duì)UMP單體參與的粘接過(guò)程和效應(yīng)進(jìn)行后續(xù)探索，以期為牙本質(zhì)粘接引入化學(xué)成分帶來(lái)新曙光。