低能量激光療法聯(lián)合Dycal用于大鼠磨牙直接蓋髓術(shù)的體內(nèi)研究

趙舉紅 仵楠 崔靈欣 張超杰 祖木熱提古麗·阿不來提 徐江

牙髓具有營養(yǎng)、防御和修復功能，當牙齒齲壞、外傷或醫(yī)源性損傷露髓時，易引發(fā)炎癥、疼痛，造成牙髓壞死，從而影響牙齒功能及壽命。因此活髓保存的研究倍受青睞。激光已被廣泛應用于臨床醫(yī)學和口腔醫(yī)學的輔助治療中，它不僅增加細胞的三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生[1]，還具有抗炎、緩解疼痛、止血、加速傷口愈合和促進損傷修復的功能[2-3]。低能量激光療法(low lever laser therapy,LLLT)也稱為光生物效應，具有生物調(diào)節(jié)作用。

瞬時受體電位通道A1(transient receptor potential A1，TRPA1)為非選擇性陽離子通道，使細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，參與細胞及個體的生理病理過程。氧化應激[4]，炎癥和神經(jīng)損傷反應等[5]。TRPA1對促血管生成和局部微環(huán)境的變化都很敏感[6]，在炎癥或組織損傷部位被大量發(fā)現(xiàn)。

本研究將評價LLLT聯(lián)合Dycal直接蓋髓術(shù)后牙髓炎癥反應、修復性牙本質(zhì)形成及檢測牙髓內(nèi)TRPA1、IL-1β的表達情況，探討二者聯(lián)合應用對牙髓損傷修復過程中炎癥反應的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠分組

64 只8 周齡清潔級雄性健康大鼠，體重(200±10) g, 恒牙列完整，無齲齒、畸形及牙體牙周疾病，經(jīng)本院動物倫理審批(批號： A2019-160-01)后將大鼠隨機分成正常對照組(NC)、低能量激光組(LLLT)、Dycal組(Dy組)和低能量激光+Dycal組(LLLT+Dy)4 組(n=16)，以左側(cè)上下頜第一磨牙為實驗牙，術(shù)后第3、 7、 14、 28天每組各處死4 只取樣(8 顆實驗牙)。

1.2 主要試劑與材料

Denlase半導體激光機(大恒新紀元科技股份有限公司)；Dycal(登士柏公司，美國)；4%多聚甲醛、水合氯醛、EDTA、 復合消化液(武漢博士德生物工程有限公司)；TRPA1(ab62053，1∶150 )、IL-1β(ab9787,1∶200)(Abcam公司，英國)；二抗、山羊血清、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗動物模型的建立

仰臥位固定大鼠，水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，待起效后消毒沖洗口腔，用渦輪機鉆于左側(cè)上下第一磨牙中央制備窩洞，待透紅后用直徑0.5 mm探針輕穿髓，LLLT組用400 μm光纖的建立半導體激光(0.2 W, CW, 10 s)處理穿髓孔，Dy組用生理鹽水沖洗，無菌棉球拭干，輕置Dycal于穿髓孔，而LLLT+Dy先用LLLT組相同條件照射穿髓孔，再輕置Dycal無,最后各組均用玻璃離子充填。實驗牙調(diào)，此過程均有同一名口腔副主任醫(yī)師在無菌下完成。于術(shù)后第3、 7、 14、 28 天各組取標本。

1.4 實驗方法及結(jié)果分析

1.5 統(tǒng)計學分析

經(jīng)SPSS 20.0軟件統(tǒng)計，各實驗組牙髓炎癥反應和牙本質(zhì)橋形成資料選擇Kruskal-WallisH非參數(shù)秩和檢驗，按α=0.05檢驗水準，進一步采用Mann-WhitneyU檢驗兩兩間分析，P<0.016 7為差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化資料服從正態(tài)分布且方差齊，運用單因素單變量的方差分析進行統(tǒng)計，P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 牙髓組織及修復性牙本質(zhì)的形態(tài)學觀察

2.1.1 正常對照牙HE染色 正常對照牙HE染色可見牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)及正常牙髓組織，成牙本質(zhì)細胞排列整齊呈柵欄狀，牙髓組織內(nèi)無明顯擴張的毛細血管和炎癥細胞(圖 1)。

圖 1 正常對照組牙髓組織學表現(xiàn)(HE， ×200)

2.1.2 牙髓炎癥及修復性牙本質(zhì)的情況 術(shù)后3 d：穿髓孔下方牙髓及成牙本質(zhì)細胞排列紊亂，血管輕度擴張，以中性粒細胞、巨噬細胞為主急性炎癥反應。術(shù)后7 d：穿髓孔處有部分牙本質(zhì)團塊，無完整的修復性牙本質(zhì)形成，血管增生明顯，以淋巴細胞為主的慢性炎癥反應。術(shù)后14 d：穿髓孔下形成比較連續(xù)的修復性牙本質(zhì),其下方的成牙本質(zhì)細胞排列較整齊,神經(jīng)纖維增多，炎癥反應減弱，擴張血管減少。術(shù)后28 d：幾乎無炎癥細胞浸潤，牙本質(zhì)形成增厚連續(xù)完整(圖 2)。

*: 開髓孔； D: 牙本質(zhì)； P: 牙髓； RD: 修復性牙本質(zhì)； Ⅰ: 炎癥細胞浸潤； Ⅱ: 骨樣牙本質(zhì); Ⅲ: 擴張的毛細血管

2.1.3 牙髓炎癥和修復性牙本質(zhì)的評價表 對各實驗組進行評分、統(tǒng)計如表 1。經(jīng)多獨立樣本非參數(shù)秩和檢驗統(tǒng)計，各實驗組的牙髓炎癥及修復性牙本質(zhì)形成在術(shù)后14、 28 d牙兩者均統(tǒng)計學差異(P<0.05)。LLLT組的炎反應最重，LLLT+Dy組的炎癥反應最輕，LLLT 組與LLLT+Dy組的炎癥反應在術(shù)后14、28 d都存在統(tǒng)計學差異(P<0.016 7)(表 2)。術(shù)后14 d，LLLT+Dy 組修復性牙本質(zhì)形成的質(zhì)量及速度好于LLLT組及Dy組，LLLT+Dy組與LLLT組、Dy組均存在統(tǒng)計學差異(P<0.016 7)(表 2)，術(shù)后28 d， LLLT+Dy組與LLLT組均存在統(tǒng)計學差異(P<0.016 7)(表 2)。

表 1 各實驗組牙髓炎癥及修復性牙本質(zhì)形成情況分級統(tǒng)計表(n=8)

表 2 第14、 28 天組間兩兩比較牙髓炎癥及修復性牙本質(zhì)形成統(tǒng)計表(n=8)

2.2 IL-1β、TRPA1在蓋髓術(shù)后牙髓中的表達

2.2.1 IL-1β及TRPA1在正常牙髓中的表達 IL-1β

主要表達在細胞質(zhì)，部分成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞表達呈弱陽性；TRPA1主要表達在細胞膜及細胞質(zhì)，部分成牙本質(zhì)細胞和少量神經(jīng)纖維表達呈弱陽性，余細胞表達呈陰性(圖 3)。

2.2.2 IL-1β在各實驗組牙髓中的表達 術(shù)后3 d:部分成牙本質(zhì)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞表達呈強陽性，內(nèi)皮細胞、成纖維表達呈陽性。術(shù)后7 d:部分成纖維細胞表達呈強陽性，成牙本質(zhì)細胞樣細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞表達呈陽性，成牙本質(zhì)細胞樣細胞增殖明顯。術(shù)后14 d:成牙本質(zhì)細胞、成牙本質(zhì)樣細胞表達呈強陽性，成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)纖維表達呈弱陽性。術(shù)后28 d:各實驗組表達減弱接近正常對照組，少量成牙本質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞表達呈陽性。少量成纖維細胞表達呈弱陽性(圖 4)。

2.2.3 TRPA1在各實驗組牙髓組織中的表達 術(shù)后3 d:成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及神經(jīng)纖維表達呈陽性，部分成牙本質(zhì)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、 肥大細胞表達呈弱陽性。術(shù)后7 d:成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞和神經(jīng)纖維表達呈強陽性，成牙本質(zhì)樣細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞表達呈陽性。術(shù)后14 d:成牙本質(zhì)細胞、成牙本質(zhì)樣細胞和成纖維細胞達呈強陽性。術(shù)后28 d:各實驗組表達減弱接近正常對照組，少量成纖維細胞表達呈陽性，少量成牙本質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞以及神經(jīng)纖維織表達呈弱陽性(圖 4)。

圖 4 IL-1β、 TRPA1在不同實驗組牙髓中的表達情況(IHC, ×400)

2.2.4 各組在蓋髓術(shù)后不同時間點TRPA1表達陽性染色的MOD值 第3、7、14、28 d中除了28 dLLLT+Dy和Dy組其他各實驗組中均與正常對照組比TRPA1陽性染色的MOD值存在顯著性差異(P<0.05)。7 d：Dy組>LLLT組>LLLT+Dy組的TRPA1陽性MOD值； 14 d：LLLT組、Dy組>LLLT+Dy組的TRPA1陽性MOD值，存在顯著性差異(P<0.05)； 28 d：LLLT組>Dy組、LLLT+Dy組TRPA1陽性MOD值，存在顯著性差異(P<0.05)(表 3)。

表 3 4 組蓋髓術(shù)后IL-1β陽性染色、TRPA1陽性染色的平均吸光度A值

3 討 論

牙髓是由成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞、血管和神經(jīng)等組成的疏松結(jié)締組織，被包繞在礦化的牙齒中，對牙齒的感覺和功能起著重要的作用[8]。若牙髓暴露或受損需行直接蓋髓術(shù)時，蓋髓材料是為了隔絕牙髓與外界有害刺激，提供牙髓修復的微環(huán)境。氫氧化鈣于1930 年被首次應用于直接蓋髓術(shù)。Dycal相對氫氧化鈣pH值較低，固化時間短， 密封性好， 是一種優(yōu)良的蓋髓劑。Er∶YAG激光提高了常規(guī)直接蓋髓(Dycal)的療效[9]。LLLT可降低IL-1β、ICAM-1等炎癥因子的表達，減輕炎癥滲出、充血和水腫。

牙髓炎癥及修復性牙本質(zhì)形成是蓋髓后評價療效的重要因素，在本研究LLLT組及LLLT+Dy組中LLLT照射穿髓孔，能量先被組織吸收，瞬間轉(zhuǎn)移到細胞，可能會引起細胞增殖分化、細胞因子及相關(guān)蛋白質(zhì)釋放來減輕炎癥，促進組織愈合。可見在蓋髓術(shù)后第3、7天牙髓炎癥LLLT組、Dy組比LLLT+Dy組反應重，LLLT組和Dy組無統(tǒng)計學意義，說明在牙髓損傷修復的前期， LLLT和Dycal具有類似的抗炎蓋髓作用， 且二者聯(lián)合效果更好。可能是因為LLLT可增強線粒體電子轉(zhuǎn)移和ATP產(chǎn)生，并刺激人中性粒細胞(PMN)的氧化爆發(fā)，提高殺滅細菌的能力[10]。第14、 28 天可見牙髓炎癥LLLT+Dy組比LLLT組反應輕，具有顯著性差異。筆者推測在蓋髓修復后期，LLLT組牙髓炎癥反應重及修復性牙本質(zhì)形成變慢均與LLLT組玻璃離子具有中重度細胞毒性，封閉性差，且與牙髓直接接觸有關(guān)。術(shù)后14 d LLLT+Dy組均比單獨蓋髓組形成修復性牙本質(zhì)效果好，這可能LLLT促進牙髓細胞、成牙本質(zhì)細胞增殖、分化和血管生成密切相關(guān)[11]。并且LLLT可增強h-BMMSCs源性成牙細胞樣細胞DMP1和ALP基因表達、細胞增殖和基質(zhì)礦化[12]。GaAIAs 激光照射大鼠磨牙，誘導牙髓礦化促進修復性牙本質(zhì)形成[13]。術(shù)后28 d時聯(lián)合組與Dy組在修復性牙本質(zhì)形成沒有統(tǒng)計學意義，說明LLLT具有時限性，與研究低功率He∶Ne激光在種植術(shù)后早期促進種植體周圍成骨細胞增殖提高成骨活性結(jié)果一致[14]。

牙髓修復程序中有TNF-α、TGF-β、Runx2、DMP1、IL-β等一系列因子參與，而IL-1β是一種促炎因子，參與牙髓炎癥并發(fā)揮著關(guān)鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)有效降低hDPSCs分泌IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子起到良好的抗炎和促進hDPSCs分化作用[15]。TRPA1是c-纖維釋放神經(jīng)肽的炎癥介質(zhì)和守門人，在組織損傷或受到機械、溫度、氧化應激等因素刺激時，相應部位釋放出的炎癥介質(zhì)不僅能夠激活 TRPA1 還可進入局部受損組織產(chǎn)生神經(jīng)源性的炎癥反應[16]。現(xiàn)研究TRPA1可誘導牙髓細胞分化，礦化形成修復性牙本質(zhì)[17]。本研究在蓋髓術(shù)后IL-1β、TRPA1表達一致,術(shù)后第3、7 天各實驗組中成牙本質(zhì)細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、炎癥細胞中均有不同程度的IL-1β、TRPA1陽性表達。LLLT 可抑制TNF-α、IL-1β和MMP-13的分泌，達到減輕炎癥疼痛的作用[18]。也有學者發(fā)現(xiàn)TRPA1在牙本質(zhì)敏感大鼠牙髓中表達上調(diào)，隨刺激強度而增加[19]。術(shù)后7 d時，兩因子陽性表達的MOD值LLLT+Dy組、LLLT組、Dy組呈遞增趨勢，且有統(tǒng)計學意義，顯示了LLLT在牙髓修復程序中可能通過減少IL-1β、TRPA1表達來減輕炎癥。

本研究通過Dycal是否聯(lián)合LLLT進行直接蓋髓后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組炎癥反應輕，修復性牙本質(zhì)形成快,可能與LLLT減少IL-1β、TRPA1表達相關(guān)，加速牙髓再生，促進骨礦化。具體機制有待進一步研究。