LncRNA AWPPH促進慢性根尖周炎骨修復的作用研究

董明 于新新 吳賽璇 劉婷姣 牛衛東

根尖周炎是細菌感染引起的根尖周組織的炎性疾病[1]。增強成骨細胞的活性對于治療根尖周炎的骨缺損是十分重要的[2]。目前對于根尖周炎的致病機制仍不清楚。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA。在真核生物中廣泛表達，并在多種生理和病理過程中發揮重要的作用[3-4]。學者通過微陣列分析了lncRNA在牙周炎組織中的表達，認為lncRNA是導致牙周炎的遺傳危險因素[5]，AC0001207，MZF1AS1和FGD5AS1 lncRNA在慢性牙周炎中被下調[6-7]。LncRNA AWPPH (AWPPH)是新發現的長非編碼RNA。研究表明AWPPH在所有的腫瘤細胞中都表達，并且促進腫瘤的遷移、增殖及侵襲[8-9]。研究指出AWPPH的過表達可以預測牙周炎的復發，AWPPH可能參與了牙周炎的發病過程[10]。但是尚無報道指出AWPPH在慢性根尖周炎中的作用。本文通過收集慢性根尖周炎臨床樣本和構建過表達AWPPH的成骨細胞株，檢測AWPPH、BMP-2及RUNX-2的表達情況，分析其相關性，研究AWPPH對成骨細胞標志因子BMP-2及RUNX-2生物學功能的影響，為慢性根尖周炎的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3T3-E1細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)； AWPPH過表達質粒(大連萬澤生物)； 總RNA提取試劑盒、 SYBR?Premix ExTaqMⅡ(大連寶生物)；CCK8(APExBIO，美國)；RIPA裂解液(北京索萊寶)；GAPDH抗體、 BMP-2抗體(南京巴傲得)；Runx-2抗體(SAB，美國)；ALP染色試劑盒(Sigma，美國)。

1.2 樣本收集

2019 年1～6 月在患者知情同意的情況下，由大連醫科大學醫院倫理委員會批準(批準號：大醫倫申：2009NO.6)，選取實驗組和對照組，其中實驗組15 例，對照組10 例。納入標準：慢性根尖周炎組：根據臨床表現和X線片診斷為慢性根尖周炎且需要拔除的患牙；患者無系統性基本。對照組：選取因正畸需要拔除的前磨牙或第三磨牙(均為根尖發育完成)。排除標準：患牙存在牙周疾病或牙周牙髓聯合病變；拔牙前3 個月服用抗生素或非甾體類抗炎藥物；年齡<18 歲。

1.3 Real time PCR

提取樣本總RNA，RNA反轉錄為cDNA,按照說明書配制反應液加入cDNA樣本并離心混勻，混勻后置于qPCR反應儀中，運行95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 進行40循環→95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s→95 ℃ 15 s。引物均由上海生物工程股份有限公司設計完成，引物序列如表 1所示。

表 1 目的基因引物序列

1.4 細胞培養

取出細胞迅速放到37 ℃恒溫水浴中，離心1 000 r/min離心5 min，加入1 mL培養液，放入37 ℃， 5% CO2孵育，約4～6 h后細胞貼壁， 24 h后更換細胞培養液，細胞密度為80%時，進行細胞傳代。

1.5 細胞轉染

建立AWPPH過表達成骨細胞系。將AWPPH cDNA插入pIRSE2-EGFP載體中，以構建AWPPH過表達載體。將成骨細胞培養過夜，以達到80%～90%時，并使用Lipofectamine 2000試劑進行轉染，將10 nmol/L載體轉染到5×105細胞中。對照組為加入空載體。

1.6 Western blot

提取樣本總蛋白，裂解液研磨， 4 ℃， 12 000 r/min離心10 min。計算樣品蛋白濃度。一抗(BMP-2，1∶1000； RUNX-2, 1∶500)， 4 ℃過夜,TBST洗3 次, 加入二抗，孵育1 h；使用BIO-RAD凝膠成像系統采集蛋白印跡結果并進行分析。

1.7 CCK8試驗

以1 000 個細胞的量，培養細胞24 h，加入10 μL CCK8溶液共同孵育4 h，測定450 nm處的吸光度。

1.8 ALP染色

以1 000個細胞的量，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，按照ALP染色試劑盒配制液體， 1 mL/孔，于37 ℃避光孵育15 min，測定450 nm處的吸光度。

1.9 統計方法

本實驗采用SPSS 22.0 統計學軟件對實驗結果進行統計學分析，采用t檢驗及卡方分析，P<0.05有顯著性差異。

2 結 果

2.1 兩組患者基本資料比較

結果如表 2所示，兩組基本資料無統計學差異(P>0.05)。

表 2 兩組患者基本資料比較

2.2 Realtime PCR檢測AWPPH、BMP-2及RUNX-2在慢性根尖周炎中表達情況

如圖 1所示，AWPPH、BMP-2及RUNX-2在慢性根尖周炎中的表達均低于對照組(P<0.05)；相關性分析表明AWPPH與BMP-2及RUNX-2存在高度相關性(P<0.001)。以上結果說明在臨床慢性根尖周炎中，AWPPH、BMP-2、RUNX-2的表達降低，并且AWPPH的表達分別與BMP-2及RUNX-2的表達具有高度相關性。

圖 1 AWPPH與BMP-2及RUNX-2在慢性根尖周炎組織中的表達

2.3 成骨細胞轉染AWPPH過表達質粒

采用熒光顯微鏡及Real time PCR檢測AWPPH過表達的轉染效率。熒光顯微鏡顯示，成骨細胞轉染AWPPH過表達質粒后，與對照組比較，AWPPH表達量增高(圖 2A)。Real time PCR檢測AWPPH過表達的轉染效率，結果顯示AWPPH表達量增高，結果有統計學差異，P<0.05(圖 2B)。結果說明，AWPPH過表達質粒構建成功。

圖 2 成骨細胞轉染AWPPH過表達質粒的轉染效率驗證

2.4 過表達AWPPH影響成骨細胞的生物學功能

通過Realtime PCR和western blot檢測過表達AWPPH后BMP-2及RUNX-2的表達情況，結果顯示成骨細胞轉染過表達AWPPH后，BMP-2及RUNX-2在基因及蛋白水平的表達都高于對照組，結果有統計學差異(P<0.05)(圖 3)。CCK8檢測轉染過表達AWPPH后，成骨細胞的增殖能力，結果顯示相對于對照組，結果有統計學差異(P<0.05)，結果如圖 3。 ALP檢測過表達AWPPH后成骨細胞的分化能力增強，結果有統計學差異(P<0.05)，具體如圖 3所示。

圖 3 過表達AWPPH對MC3T3-E1細胞的生物學功能的影響

3 討 論

根尖周炎是一類由細菌感染引起的常見口腔疾病，其臨床表現為根尖周組織出現軟組織及骨組織的病變，進而造成牙齒的脫落，目前關于根尖周炎的研究主要集中于炎性因子的表達[11-13]。由于lncRNA是目前研究的熱點，我們在之前的實驗中采用基因芯片篩選慢性牙周炎與正常對照組之間具有高度差異表達的lncRNA，我們發現AWPPH在慢性牙周炎中的表達與對照組存在明顯差異(P<0.01)。所以我們在本次實驗中選取AWPPH作為本實驗的主要研究對象。AWPPH作為新發現的lncRNA被認為是治療非創傷性股骨頭骨壞死的新靶點，研究表明，AWPPH可以通過上調Runx2治療非創傷性股骨頭骨壞死[14]。

該實驗結果顯示AWPPH在慢性根尖周炎中的表達降低，且與成骨標志因子存在相關性，說明AWPPH與成骨細胞的生物學功能可能存在相關性。也有報道指出在復發性慢性牙周炎的患者血液中發現AWPPH表達增高，可能是在復發患者血液中AWPPH激活了成骨細胞的增殖機制，以保護骨動態平衡的穩定，說明AWPPH與成骨細胞關系密切，與我們的結果得到了一致的結果[10]。由于AWPPH在慢性根尖周炎中表達降低，為了更好的檢測AWPPH對于成骨細胞的生物功能影響，我們通過構建AWPPH過表達質粒，將其轉染成骨細胞，結果發現過表達AWPPH可以提高BMP-2及RUNX-2的基因及蛋白表達增高。說明AWPPH可以促進成骨細胞標志因子的表達，進而促進骨形成。有學者指出hMSC-BM細胞中通過短發夾RNA沉默抑制AWPPH后，RUNX-2的表達出現了抑制，此部分結果也與本研究的結果一致。本研究結果顯示過表達AWPPH后可以促進成骨細胞的增殖與分化，此部分實驗進一步驗證了AWPPH在成骨細胞中的作用。本實驗主要對于AWPPH在慢性根尖周炎中的成骨功能進行了研究，但是尚未研究其具體的作用機制，有學者指出AWPPH可能與miRNA相互作用參與牙周炎的發生，進而維持牙周炎的骨動態平衡[15-16]。也有學者指出AWPPH也可以通過PI3K/AKT途徑激活細胞的生物學功能[17-18]。本課題組將在以后的實驗中繼續研究AWPPH促進成骨細胞增殖與分化的作用機制，進而為促進慢性根尖周炎的骨修復提供新的靶點。