miR-103對牙髓干細胞增殖及其向成牙本質細胞分化的影響

李鳳月 齊洪光 于登臣 袁佳運 侯寶華

牙髓再生、自體牙再造等再生醫學研究在牙體牙髓病領域中得到了廣泛關注，而作為“種子細胞”的牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)成為近年來的研究熱點[1-2]。目前,對DPSCs增殖、分化等生物學特性的調控機制尚不完全清楚，牙體牙髓領域的再生醫學研究仍處于初級階段[3]。因此，深入研究DPSCs的增殖與分化等生物學行為的調控機制具有重要意義。近年來， miR-103對DPSCs的作用尚不清楚。本研究通過從成人第三磨牙中分離培養DPSCs，利用轉染技術在DPSCs中過表達及降低miR-103的含量，繼而檢測miR-103對DPSCs增殖及分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

澳洲胎牛血清、低糖的DMEM細胞培養基、I型膠原及雙抗等細胞培養試劑(Gibco公司，美國)；轉染試劑lipo2000(Invitrogen公司，美國)；miRNA核苷酸序列(南京舟達公司)；q-PCR試劑套裝(RNA的提純、反轉錄及擴增試劑盒)(Takara公司，日本)；q-PCR引物(上海生工生物公司)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天公司)；Runx2和Osx等抗體(Abcam公司，英國)；茜素紅、地塞米松、維生素C和磷酸甘油(Sigma公司，美國)；細胞培養瓶、培養皿及離心管(Corning公司，美國)； 實時熒光定量PCR儀(ABI7500fast,Applied Biosystems公司，美國)；酶標儀(SPS5845,上海沛歐分析儀器有限公司)；顯微鏡(cx21fs1,Olympus公司，日本)；電泳儀(天能EPS600, 上海天能公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 從成人第三磨牙中分離DPSCs，方法如下：所用牙齒均來自因阻生或因正畸治療需要而拔出的健康第三磨牙。第三磨牙拔出后進行徹底消毒，用含有青霉素及鏈霉素的清洗液浸泡后用環鉆劈開，無菌條件下取出牙髓組織，并將上述組織修剪成約1 mm3的組織塊，用I型膠原酶完全覆蓋消化組織，短暫反應后，將消化后的組織塊置于培養瓶中培養，將培養瓶置于常規孵箱中培養，隔天置換培養基，待DPSCs從組織塊中爬出。待細胞融合率在70%左右時進行細胞傳代，取3～8 代的細胞用于實驗[4]。

利用lipo2000將公司合成的80 nmol/L的miRNA相關核苷酸序列轉染進DPSCs。本實驗根據轉染入細胞的核苷酸序列不同，將細胞分為對照組(Control)、miRNA陰性對照組(miR-NC)、miR-103過表達組(miR-mimic)和miR-103降低表達組(anti-miR)[5]。

1.2.2 茜素紅染色 完成細胞轉染后，利用75%乙醇固定培養皿中的DPSCs，利用雙蒸水沖洗細胞3 次，每孔加入40 mmol/L的茜素紅染料浸沒，染色10 min后清洗染料，并再次利用雙蒸水緩慢沖洗培養皿，在培養皿中加入緩沖液后繼續室溫孵育， 30 min后觀察紅色的礦化結節。采用梯度稀釋法制作茜素紅-吸光度標準曲線，進行半定量檢測[6]。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 轉染效率檢測

在利用合成的核苷酸轉染細胞后，利用q-PCR技術檢測每組細胞miR-103的含量變化，驗證轉染效率。和miR-NC 相比，miR-mimic組miR-103含量大幅增加(P<0.05)，而anti-miR細胞miR-103含量顯著下降(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內miR-103含量未發生明顯變化(P>0.05)(圖 1)。

圖 1 q-PCR技術檢測轉染后各組細胞內miR-103的含量 圖 2 CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力

2.2 miR-103抑制DPSCs的增殖

驗證轉染效率后，利用CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力如圖 2，和miR-NC 相比，miR-mimic組DPSCs的增殖能力減弱(P<0.05)，而anti-miR組DPSCs的增殖能力增強(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組DPSCs的增殖能力未發生明顯變化(P>0.05)。

2.3 miR-103降低Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量

利用q-PCR技術檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化如圖 3，和miR-NC 相比，miR-mimic組Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量減少(P<0.05)，而anti-miR細胞Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量未發生明顯變化(P>0.05)。

圖 3 q-PCR技術檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化

2.4 miR-103降低Runx2和Osx蛋白的表達

利用Western blot技術檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達如圖 4，和miR-NC 相比，miR-mimic組Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達減少(P<0.05)，而anti-miR細胞Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達未發生明顯變化(P>0.05)。

圖 4 Western blot技術檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達

2.5 miR-103抑制DPSCs礦化結節的形成

利用茜素紅染色的方法檢測各組細胞的礦化能力如圖 5，和miR-NC相比， miR-mimic組礦化能力減弱(P<0.05)，而anti-miR組礦化能力增強(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組礦化能力未發生明顯變化(P>0.05)。

圖 5 茜素紅檢測各組細胞的礦化能力

3 討 論

牙髓牙體疾病在口腔疾病中發病率較高，而就診的患者中有很大一部分的牙體牙髓已經發生了不可逆的損傷，往往只能通過去除病變的牙體及牙髓的手段治療，達到癥狀緩解及恢復功能的目的[7]。而隨著組織工程技術的飛快發展，再生醫學在牙體牙髓研究領域也成為研究熱點。DPSCs是極具臨床應用潛力的間充質干細胞，當牙髓組織受到損傷后DPSCs根據損傷情況，在精密的網絡調控下分化，修復損傷的牙髓組織或牙本質[8]。而DPSCs增殖與分化等生物學行為的調控機制非常復雜，尚未完全闡明。

文獻綜述后發現miR-103在骨髓間充質干細胞分化調控及成骨細胞增殖調控中具有重要作用[5，9]，為驗證miR-103對DPSCs增殖和分化的調控作用，研究利用細胞轉染核苷酸片段的技術體外成功過表達和降低表達miR-103。隨后發現過表達miR-103抑制DPSCs增殖，這與之前學者報道一致。Sun等[5]證實miR-103能夠通過作用于鈣離子通道關鍵蛋白Cav1.2抑制成骨細胞的增殖。Liao等[10]發現miR-103通過直接靶向周期相關蛋白CCNE1和CDK2抑制小鼠腸道細胞的增殖。還有學者證明miR-103在乳腺癌細胞中高表達，并在其增殖等生物學行為中發揮重要調控作用[11]。

隨后還驗證了miR-103對DPSCs內Runx2, Osx和ALP等分化指標表達的影響。Osx也是骨形成調控過程中不可缺少的成骨細胞特異性轉錄因子，缺少Osx會引起DPSCs向成牙本質細胞的分化障礙[6]。在本實驗中，發現miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質細胞的分化。為了進一步驗證miR-103抑制DPSCs向成牙本質細胞的分化，利用茜素紅染色檢測了miR-103對DPSCs礦化能力的影響，發現miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質細胞的分化，并最終抑制了DPSCs的礦化作用。這和之前報道一致，Zuo等[9]發現miR-103能夠通過靶向作用Runx2在細胞水平和動物水平抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化和礦化能力。

綜上所述，miR-103能夠抑制DPSCs的增殖能力，并抑制DPSCs向成牙本質細胞的分化。本實驗探討了miR-103對DPSCs增殖和分化的影響，但miR-103對DPSCs增殖和分化的調控機制仍有待進一步研究與探索。