CAPN14通過促進CDK5蛋白的降解在口腔鱗癌中發揮抑癌作用

穆磊 張紅 段曉波 陳曉濤

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是世界第八大最常見的癌癥類型。在中國，口腔癌的發病率約為3/10 萬人[1]，且每年都在增長[2]，與吸煙、酗酒及檳榔等密切相關[3]。對于口腔鱗癌經典的手術治療結合放化療藥物輔助，但是其死亡率仍然很高，腫瘤轉移是患者死亡的主要原因。因此，明確口腔鱗癌的轉移機制已成為目前的熱點問題[4]。

鈣蛋白酶(Calpains，CAPNs)參與腫瘤組織進展的關鍵過程如增殖及轉移等，目前已經有多種抗癌藥物通過激活CAPNs誘導細胞毒性[5]。調控CAPNs家族蛋白可作為逆轉口腔鱗癌進展的重要靶點[6]。本研究通過生物信息學方法發現在口腔鱗癌中，CAPNs表達異常，以CAPN14最為明顯，且存在其潛在的相互作用蛋白CDK5。本研究分析了CAPN14在口腔鱗癌組織和細胞系中的表達特征，并對CAPN14對CDK5表達及細胞惡性行為的調控進行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常口腔上皮細胞HOEC、口腔鱗癌細胞系SCC9、SCC25、CAL27(ATCC，美國)； 胎牛血清FBS及DMEM/F12培養基(Gibco，美國)； 青霉素-鏈霉素溶液、無酶水、異丙醇及無水乙醇(北京碧云天)；嘌呤霉素、PVDF膜激活液、一抗稀釋液、二抗稀釋液及CCK-8試劑盒(北京索萊寶)；放線菌酮、胰蛋白酶及陽離子聚合物(Sigma，美國)；轉染脂質體LipofectamineRNAiMAX Reagent(Thermo Scientific，美國)；病毒包裝質粒pLP1-gag/pol、pLP2-Rev及pLP-VSVG(Addgene，美國)；Trizol、RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green核酸熒光染料(Takara，日本)；CAPN14、CDK5、山羊抗兔-HRP及山羊抗鼠-HRP抗體(Abcam，美國)。

1.2 儀器與設備

DM500光學顯微鏡(徠卡，德國)；Nanodrop2000c分光光度計(Thermo Scientific, 美國)；多孔酶標儀(Molecular Devices，美國)；凝膠成像儀、Real-time PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 細胞培養、細胞系的建立及實驗設計分組

HOEC及SCC9、SCC25、CAL27在細胞75 cm2培養瓶中用培養基(DMEM/F12+10% FBS+1% 青霉素-鏈霉素溶液)培養，于37 ℃+5% CO2培養箱中培養。傳代用胰酶消化， 1∶3傳代并繼續培養，選取對數生長期的細胞用作后續實驗。

細胞實驗分為4 組， 空白組：CAL27細胞未予以任何處理；對照組：CAL27細胞用對照載體進行轉染； 過表達組：CAL27細胞用CAPN14過表達載體進行轉染；回復組：過表達組細胞采用CDK5過表達載體進行轉染。四組細胞處理后均加入10 μmol/L放線菌酮抑制細胞蛋白合成觀察目的蛋白的降解速度[7-8]。

轉染方法：10 μL LipofectamineRNAiMAX轉染pLP1-gag/pol(每孔0.75 μg)、pLP2-Rev(每孔0.3 μg)和pLP3-VSVG(每孔0.45 μg)及目的載體(每孔1.5 μg)于人293T細胞中，收集病毒懸液， 0.22 μm過濾器過濾。接種CAL27細胞于60 mm培養皿中，DMEM/F12培養基+10%胎牛血清+1 mL病毒懸液培養，加入3 μL 聚凝胺，連續感染2 d，嘌呤霉素篩選后即獲得相應細胞系。

1.4 CCK-8檢測細胞的增殖能力

對數生長期的待測細胞以每孔5 000 個接種至96 孔板，培養24 h后，待細胞貼壁后，棄上清，加入生長培養基分別培養24、 48、 72 h，每孔加入10 μL CCK-8， 37 ℃+5% CO2孵箱中孵育2 h，多孔板酶標儀檢測450 nm吸光度。計算各組細胞的相對增殖能力。

1.5 Transwell檢測細胞侵襲能力

取Matrigel膠鋪于4 孔Transwell上室面，每孔100 μL，風干后使用無血清DMEM/F12培養基水化。100 μL的4 組細胞懸液接種于上室面，每組細胞均接種2×105個。 24 h后輕輕擦掉上室面的細胞， 4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色，進行細胞計數并進行統計學分析。

1.6 Western Blot檢測CAPN14與CDK5蛋白表達

接種各組細胞于6 孔細胞培養板中， 5 μg/mL CHX處理細胞0、 6、 12 h，使用RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑混合后冰上裂解各組細胞，加上樣緩沖液煮沸10 min。選用β-actin作為內參。BCA試劑盒測定蛋白濃度，同時選取20 μL的目的蛋白先進行β-actin抗體的電泳(一抗濃度1∶400)，比較各組之間的灰度值，進行調整進行CAPN14與CDK5的電泳。200 mA 90 min濕轉至PVDF膜，TBSTw封閉液封閉1 h， 一抗 4 ℃過夜，二抗37 ℃ 1 h，發光液曝光顯影。

1.7 qPCR檢測組織與細胞中CAPN14和CDK5的表達

根據臨床和病理標準，術中獲得42 例口腔鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織。所有樣本均在2019 年4 月～2019 年10 月本院口腔手術中進行采集。術中獲取的組織標本保存于液氮中進行下一步實驗操作。使用Trizol提取組織及細胞中的Total-RNA，提取完成后檢測RNA純度后。參考逆轉錄試劑盒說明書，將提取后的RNA進行逆轉錄，得到cDNA產物。根據PCR試劑盒說明加入設計完成的引物，行PCR反應，β-actin作為內參，并進行定量分析。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 CAPN14在口腔癌中的生物信息學分析

TCGA數據庫分析顯示，多種CAPNs在頭頸鱗癌(Head and neck squamous carcinoma，HNSC，口腔鱗癌已歸類至HNSC中)組織中表達異常，CAPN14變化倍數最高，正常及HNSC組織中表達的中位數分別為18.974及0.510(P<0.001，圖 1A～1B)；STRING預測結果顯示CAPN14與CDK5存在潛在的相互作用(圖 1C)；KMPLOT數據庫分析結果顯示高表達CAPN14的HNSC患者生存時間長于低表達患者(P<0.05，圖 1D)，而高表達CDK5的HNSC患者生存時間顯著縮短(P<0.01， 圖 1E)。

圖 1 CAPN14在口腔癌中的生物信息學分析

2.2 口腔鱗癌組織與癌旁組織、HOEC、SCC9、SCC25、CAL27細胞中CAPN14表達及比較

qPCR結果提示：相比癌旁組織(0.07±0.01)，口腔鱗癌組織中CAPN14的表達含量(0.16±0.01)較低(P<0.01)；口腔鱗癌細胞系SCC9(0.55±0.09)、SCC25(0.74±0.06)、CAL27(0.36±0.04)中的CAPN14表達含量較正常口腔上皮細胞HOEC(1.00±0.08)低(P<0.01)，以此為基礎，選取CAPN14內源性表達量最低的CAL27細胞作為體外細胞實驗模型(圖 2)。

2.3 4 組細胞增殖能力及其比較

CCK-8法結果顯示：相比對照組，過表達組細胞的增殖能力明顯減弱(P<0.01)；相比過表達組，回復組細胞的增殖能力明顯增加(P<0.01)(圖 3)。

圖 2 CAPN14在口腔鱗癌組織及細胞中的表達情況 圖 3 4 組細胞增殖能力及其比較

2.4 4 組細胞侵襲能力及其比較

Transwell實驗顯示：相比對照組，過表達組侵襲細胞明顯減少(P<0.01)；相比干擾組，回復組的侵襲細胞明顯增加(P<0.01)(圖 4)。

圖 4 4 組細胞侵襲細胞及比較

2.5 4 組細胞中CAPN14與CDK5蛋白表達水平及其比較

Western blot結果顯示：相比對照組，過表達組CDK5的蛋白表達水平顯著降低，CDK5蛋白半衰期明顯縮短；而相比過表達組，回復組細胞CDK5的蛋白表達水平顯著增高，CDK5蛋白半衰期明顯延長(P<0.01)(圖 5)。

圖 5 4 組細胞的CAPN14與CDK5蛋白表達含量及其比較

2.6 4 組細胞中CAPN14與CDK5基因表達水平及其比較

qPCR結果顯示：空白組、對照組、過表達組及回復組細胞CAPN14的基因表達分別為1.06±0.14、1.00±0.10、14.34±1.51、16.25±2.04，CDK5的基因表達分別為1.13±0.09、1.00±0.07、1.24±0.13、5.89±0.63。相比對照組，過表達組及回復組細胞CAPN14的基因表達顯著增高(P<0.01)，而過表達組CDK5表達無顯著變化(P>0.01)，回復組CDK5表達顯著增高(P<0.01)(圖 6)。

圖 6 4 組細胞的CAPN14與CDK5基因表達及比較(相比對照組， **: P<0.01)

3 討 論

口腔鱗癌由于其較強的局部組織侵襲能力，并破壞口腔面部外觀，引發頸部淋巴結轉移和血源性播散[9]，仍然是一種致死致殘性疾病，造成了嚴重的社會經濟負擔[10]。在世界范圍內， 每年出現大約30 萬新病例，近期發病率顯著上升，尤其是在年輕人中。因此， 探索口腔鱗癌的耐發病機制及研究期新藥物靶點是目前研究口腔鱗癌的熱點與難點[11]。

鈣激活中性蛋白酶(Calpains，CAPN)是一組非溶酶體Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白酶，在人類基因組中，這組酶有15 種亞型，廣泛存在并表現出組織特異性的表達模式[12]。鈣蛋白酶廣泛參與細胞增殖、轉移、凋亡和信號轉導等不同的生理病理過程，并且越來越多的證據表明鈣蛋白酶在腫瘤轉移中的中心作用是通過參與幾個關鍵的過程[13]，包括局部粘附動力學、細胞骨架重構、上皮-間充質轉化和細胞凋亡等，從而被研究者認為是潛在的抗癌靶點[14]。基于CAPN在癌癥中潛在的重要價值，本研究通過生物信息技術分析篩選出在正常口腔組織與口腔鱗癌組織之間差異較大的CAPN14，并且STRING預測結果顯示CAPN14與細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)存在潛在的相互作用。CDK5是細胞周期蛋白依賴性激酶家族中的一個非典型成員，由于其激活因子p35在有絲分裂后的神經元中大量存在，因此在過去十年中被認為是一種神經元特異性激酶[15]。最近的研究表明，CDK5在非神經元細胞中參與了一系列的生物學和病理學過程，在各種腫瘤細胞中普遍失調[16]。CDK5的下調或者其抑制劑已被證實通過多種機制發揮抗癌作用[17]，并可協同化療藥物的殺傷作用[18]。因此，結合相關文獻和生物信息學結果，我們推測CAPN14可能通過調控CDK5的表達從而影響口腔鱗癌細胞的惡性表型。

本研究結果顯示，相比口腔鱗癌旁組織，鱗癌組織中CAPN14的表達含量較低，且口腔鱗癌細胞系SCC9、SCC25、CAL27中的CAPN14表達含量較正常口腔上皮細胞HOEC低，這提示CAPN14的低表達與口腔鱗癌的發生與進展密切相關。此外，生物信息學結果表明CAPNs在HNSC組織中表達顯著異常，以CAPN14最為明顯；高表達CAPN14的HNSC患者生存時間長于低表達患者，而高表達CDK5的HNSC患者生存時間顯著縮短，同時CAPN14與CDK5蛋白存在潛在的相互作用。因此，本研究推測CAPN14可調控CDK5的表達從而影響口腔鱗癌的惡性表型。實驗中，我們首先在CAL27細胞中過表達CAPN14，發現過表達組細胞中CDK5的含量明顯降低，CAL27細胞的增殖轉移能力及CDK5蛋白的半衰期較空白組與對照組明顯下降；在過表達CAPN14的CAL27細胞中回復CDK5表達后，CAL27細胞的增殖轉移能力較過表達組細胞明顯上升，CDK5蛋白的半衰期明顯延長，這提示CAPN14可促進CDK5蛋白的降解抑制口腔鱗癌細胞的惡性增殖及轉移能力。

綜上所述，本研究探索了CAPN14與CDK5在口腔鱗癌的發生與發展中的作用及機制，為其作為口腔鱗癌的治療靶點提供了實驗依據，將通過構建體內動物模型進一步佐證CAPN14與CDK5在口腔鱗癌中的重要價值，以期為口腔鱗癌的治療提供新的線索。