柑橘屬同源藥對青皮-枳殼的薄層色譜鑒別

牛露露， 劉 磊， 李瑤瑤， 樸成玉， 王子丹， 吳修紅*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150000；2.哈爾濱濟仁中醫醫院，黑龍江 哈爾濱 150000)

藥對介于中藥與方劑之間，包含藥對配伍、藥對成方、藥對組拆。青皮、枳殼是疏肝、理氣、消積、利膽方劑中的常用藥對[1-2]，兩者同為蕓香科植物藥材[3]，因此含有大量相同或相似的化學成分[4]。這些相同或相似的化學成分雖然在青皮、枳殼中的含量各不相同，但仍給兩者的薄層定性鑒別帶來一定干擾。根據2020年版《中國藥典》規定，枳殼藥材項下薄層色譜鑒別的對照指標為柚皮苷和新橙皮苷，青皮藥材項下薄層色譜鑒別的對照指標為橙皮苷，而橙皮苷和新橙皮苷屬于同分異構體，化學極性相似，比移值(Rf)相近，熒光斑點經常重合，無法很好地分開，常給含有青皮-枳殼藥對的成方制劑的薄層鑒別帶來極大困難。本文通過查閱《中國藥典》成方制劑和單味制劑部分所載青皮和枳殼的薄層鑒別方法，歸納整理其供試品制備及展開方法，并選取部分代表性方法進行“青皮”“枳殼”的鑒別，優化其供試品制備方法及展開方法。理氣和胃顆粒由柴胡、郁金、白芍、瓦楞子、牡蠣、黃連、清半夏、青皮、枳殼、川楝子、厚樸組成，具有行氣解郁、和胃降逆功效[5]。以理氣和胃顆粒作為研究對象，以期建立一種青皮-枳殼藥對供試品制備方法簡單，斑點分離度良好，熒光顯色清晰，重現性良好的薄層鑒別方法。

1 青皮、枳殼的薄層鑒別

1.1 方法

1.1.1 青皮 以“青皮對照藥材”“橙皮苷”為關鍵詞，對2020年版《中國藥典》進行搜索，剔除可能形成干擾的含陳皮和橘紅的方劑，將搜索到的成方制劑名稱、供試品制備方法、薄層固定相、展開系統、顯色劑、檢視波長等信息錄入Excel軟件中，采用Cytoscape 3.7.2軟件將以上信息進行可視化。

1.1.2 枳殼 以“枳殼對照藥材”“柚皮苷”為關鍵詞，對2020年版《中國藥典》進行搜索，剔除可能形成干擾的含化橘紅和骨碎補的中藥方劑，將搜索到的成方制劑名稱、供試品制備方法、薄層固定相、展開系統、顯色劑、檢視波長等信息錄入Excel軟件中，采用Cytoscape 3.7.2軟件將以上信息進行可視化。

1.2 結果

1.2.1 青皮 共篩選出3個符合條件的成方制劑，其中顆粒劑2個，丸劑1個；供試品制備方法主要為甲醇超聲或回流，所用薄層固定相有聚酰胺和硅膠G；展開系統有二氯甲烷-丙酮-甲醇，以及分別用乙酸乙酯-甲醇-水、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水進行二次展開；展開后以三氯化鋁試液為顯色劑，在紫外燈(365 nm)下檢視。見圖1。

1.2.2 枳殼 共篩選出27個成方制劑，其中丸劑11個，顆粒劑5個，片劑、膠囊劑、口服液各3個，散劑、膏劑各1個；其供試品制備方法有單純溶劑提取、提取后進一步純化；提取方法主要有甲醇或乙醇超聲或回流，水或乙酸乙酯回流等；純化方法主要有乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱層析等；所用薄層固定相除2個使用聚酰胺，1個使用硅膠H，其余均為硅膠G；展開系統以氯仿-甲醇-水為主(占比37%)；檢視條件均為三氯化鋁試液顯色，在紫外燈(365 nm)下檢視。見圖2。

圖1 成方制劑中青皮薄層鑒別方法的拓撲圖

圖2 成方制劑中枳殼薄層鑒別方法的拓撲圖

2 理氣和胃顆粒中青皮、枳殼的薄層色譜鑒別

2.1 材料 GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；ZF-8D型暗箱四用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；PR124ZH奧豪斯電子分析天平(上海高致精密儀器有限公司)；SB-5200DT超聲波清洗機(寧波新藝超聲波設備有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；聚酰胺薄膜(10 cm×20 cm，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)；硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)；玻璃點樣毛細管(內徑0.5 mm，華西醫科大學儀器廠)。

理氣和胃顆粒(哈爾濱濟仁中醫醫院，批號200401、200403、200407)。橙皮苷(批號110721-201818)、柚皮苷(批號110722-201815)、新橙皮苷(批號111857-201804)對照品及枳殼(批號120981-201605)、青皮(批號121155-201704)對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院。青皮、枳殼藥材經黑龍江中醫藥大學生藥學教研室孫慧峰教授鑒定為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮和蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實。所用試劑為分析純；水為蒸餾水。

2.2 方法與結果

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg該成分的溶液；精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg兩者的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2.1 方法一 取顆粒10 g，研細，加乙酸乙酯30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，即得。

2.2.2.2 方法二 取顆粒10 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，即得。

2.2.3 對照藥材溶液制備 取青皮、枳殼對照藥材各1 g，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取不含青皮、不含枳殼、不含青皮和枳殼的陰性藥材各5 g，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.2.5 板層考察

2.2.5.1 聚酰胺板 吸取對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，點于同一聚酰胺板上，分別以氯仿-甲醇(8∶1)、二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶2)為展開劑展開，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻后在紫外光燈(365 nm)下檢視[6]。

2.2.5.2 硅膠G板 吸取供試品、對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G板上，分別以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(4∶2∶0.15∶5)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(3∶7∶0.1)為展開劑展開，前者噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻后置于紫外光燈(365 nm)下檢視；后者晾干后，直接在紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.2.6 結果分析 2種供試品溶液制備方法點樣效果相同，但“2.2.2.1”項下方法工藝和操作更簡便。圖3顯示，以聚酰胺板、二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶2)展開時斑點更清晰，分離效果更好，而且該方法有對照品，可鑒別出的成分為橙皮苷。

注：S為橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為青皮對照藥材，5為缺青皮陰性樣品。圖3 青皮薄層鑒別方法考察

2.2.7 展開劑比例優化 以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶2)展開時，斑點Rf整體偏高，故需進行優化。吸取對照品、供試品、青皮對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，點于同一聚酰胺板上，分別以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)、二氯甲烷-丙酮-甲醇(7∶1∶1)為展開劑展開，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻后在紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖4。由此可知，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑展開時主斑點Rf值適中，分離效果較好。

注：S為橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為青皮對照藥材，5為缺青皮陰性樣品。圖4 青皮薄層鑒別展開劑考察

2.2.8 展距考察 吸取對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，點于同一聚酰胺板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑，設定展距分別為8、10 cm，展開，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻后在紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖5～6。由此可知，不同展距下斑點大小無差異，Rf值也相近；但展距為10 cm時斑點顏色較亮，分離效果優于8 cm，故確定為10 cm。

注：S為橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為青皮對照藥材，5為缺青皮陰性樣品。圖5 青皮薄層鑒別展距考察

注：S為柚皮苷、新橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為枳殼對照藥材，5為缺枳殼陰性樣品。圖6 枳殼薄層鑒別展距考察

2.2.9 溫度考察 吸取對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，點于同一聚酰胺板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑，分別于4 ℃、室溫(20～25 ℃)下展開10 cm，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻，在紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖7～8。由此可知，在4 ℃下Rf值整體偏小，分離度較差，展開效果不如在室溫下，故確定為室溫。

注：S為橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為青皮對照藥材，5為缺青皮陰性樣品，6為缺青皮和枳殼陰性樣品。圖7 青皮溫度考察

注：S為柚皮苷、新橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為枳殼對照藥材，5為缺枳殼陰性樣品。圖8 枳殼溫度考察

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 按照薄層色譜法(通則0502)[7]，吸取對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液各10 μL，點于同一聚酰胺板上，按“2.2.5”項下方法操作，結果見圖9～10。由圖9可知，供試品色譜中Rf值為0.60的藍色圓點與對照品橙皮苷顏色及位置相同；由圖10可知，供試品色譜中Rf值為0.66的藍色圓點與對照品新橙皮苷所呈顏色及位置相同，Rf值為0.48的藍色圓點與對照品柚皮苷所呈顏色及位置相同，同時各成分分離良好，陰性無干擾，表明該方法專屬性強[8]。

注：S為橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為青皮對照藥材，5為缺青皮陰性樣品，6為缺青皮和枳殼陰性樣品。圖9 青皮專屬性考察

注：S為柚皮苷、新橙皮苷對照品，1～3為供試品，4為枳殼對照藥材，5為缺枳殼陰性樣品。圖10 枳殼專屬性考察

2.3.2 穩定性 按“2.2”項下方法制備對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液，按照薄層色譜法(通則0502)，于制備后0、2、4、6 d各吸取10 μL，點于同一聚酰胺板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑，展開10 cm，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻，在紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖11～12，可知溶液在6 d內穩定性良好[9]。

2.4 驗證試驗 按“2.2”項下方法制備對照品、供試品、對照藥材、陰性樣品溶液，以二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑，展距10 cm，在室溫(20～25 ℃)下展開，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，吹風機加熱片刻，在紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖13。由此看來，供試品色譜在與對照品色譜相應位置上呈相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

3 討論

圖11 青皮穩定性考察

圖12 枳殼穩定性考察

注：1為缺青皮陰性樣品，2為青皮對照藥材，3為橙皮苷對照品，4～6為供試品，7為柚皮苷、新橙皮苷對照品，8為枳殼對照藥材，9為缺枳殼陰性樣品。圖13 青皮、枳殼薄層鑒別

《神農本草經》提出“藥有陰陽配合”[10]，青皮疏肝理氣[11]，枳殼理氣寬中[12]，兩藥均為作用溫和的理氣藥，且同為蕓香科柑橘屬植物藥材，因此含有大量相同或相似的化學成分[13]，如青皮含有的黃酮類成分主要有橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素、桔皮素等[14]，枳殼含有的黃酮類成分主要有橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、異柚皮苷等[15]，兩藥皆含橙皮苷，但因含量的差異可加以鑒別[16]。因為枳殼中含青皮的薄層指標成分橙皮苷，所以在青皮的專屬性實驗中增加了青皮、枳殼的雙陰性樣品，剔除干擾。而兩者成分的交叉，給同時含有青皮-枳殼藥對的成方制劑的薄層定性鑒別帶來很大困難。而聚酰胺薄膜涂層具有較好的親水和親脂雙重性能，既能分離水溶性物質，也能分離脂溶性物質，對于黃酮類的層析分離有特效。因此，本實驗以乙酸乙酯作為供試品提取溶劑，聚酰胺為固定相，二氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1.5)為展開劑，展距10 cm時，青皮、枳殼中的各成分均能得到良好分離，尤其是同分異構體橙皮苷和新橙皮苷分離較好，展開效果清晰，重現性好，且陰性對照無干擾，表明該方法可用于理氣和胃顆粒中青皮-枳殼藥對的薄層鑒別，并為含有青皮-枳殼藥對的其它成方制劑的薄層鑒別提供了一定參考。