POLQ對SACC-83細胞的影響及POLQ基因表達調控因子預測

白晗 劉涵 朱蕾 劉超 李楠 肖晶

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma， SACC)具有高復發及轉移傾向的特點，患者遠期生存率低，無有效治療措施[1-3]。因此，闡明SACC發生發展的生物學分子機制，對于優化SACC治療策略具有重要意義。

POLQ(polymerase theta)基因高表達于特定的正常組織及多種腫瘤組織中，主要參與alt-NHEJ(alternative non-homologous end joining)修復通路[4-6]。本課題組前期研究發現PTEN(homologue deleted on chromosome 10)低表達的SACC中POLQ高表達，POLQ與SACC惡性程度及較差的預后正相關，且PTEN與POLQ無直接相互作用，表明POLQ是受PTEN間接調控的促癌因子，但調控機制尚不明確。

本研究分析了POLQ在腫瘤及正常組織中的差異表達，探討了POLQ作為SACC治療靶點的可能性，并初步探究POLQ異常高表達的調控機制，提出治療SACC的新靶點。

1 材料與方法

1.1 基因表達分析

利用TIMER2.0數據庫(http://timer.comp-genomics.org/)，評估腫瘤樣本和同位正常組織中POLQ表達量的差異。

1.2 細胞培養

SACC-83細胞系應用含10%胎牛血清(Gibco，10099-141, 美國)及1%雙抗(Gibco，15140122)的1640培養基(Gibco，C11875500BT)于恒溫37 ℃、 5% CO2、相對濕度95%以上的無菌培養箱中培養， 每48 h換液一次。

1.3 細胞轉染

細胞接種于6 孔板貼壁后按照Lipofectamine?3000(Invitrogen，L3000015，美國)說明書配制并加入轉染試劑，6 h后換液。shRNA及siRNA由上海吉瑪公司合成，序列為：對照組shControl(5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′)、POLQ干擾組shPOLQ(5′-CACCGGATATATTTCCTGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACAGGAAATATATCCTTTTTTG-3′)、PTEN干擾組siPTEN(5′-GAUCUUGACAAAGCAAAUATT-3′)以及對照組siControl(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗

轉染24 h的細胞消化后接種于96 孔板， 5 000 個/孔，培養1～6 d后，棄培養基，加入CCK-8(北京全式金生物，FC101)10 μL和含10% FBS的培養基100 μL，培養2 h，檢測450 nm的吸光度值。

1.5 平板克隆實驗

轉染24 h后常規消化，以5 000 個/孔接種于6 孔板常規培養，直至肉眼可見克隆后，棄培養基，用預冷無水乙醇4 ℃固定30 min，洗滌后用0.1%結晶紫(索萊寶，G1063)靜置染色30 min，雙蒸水清洗至細胞克隆清晰可見后，拍照呈像。

1.6 qRT-PCR

轉染72 h后收集細胞，用Trizol法(Takara，9109，日本)提取細胞總RNA，反轉錄(Takara，RR047A)，并擴增(Takara，RR820A)所得cDNA(95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 循環40 次)。引物由Takara公司合成，序列見表 1。

表 1 qRT-PCR引物序列

1.7 啟動子及轉錄因子預測

應用Cistrome數據庫(http://dbtoolkit.cistrome.org/)預測與POLQ啟動子結合的轉錄因子，AnimalTFDB3.0數據庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/)預測轉錄因子的特異性結合位點，TIMER2.0數據庫(http://timer.comp-genomics.org/)分析蛋白表達相關性。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 POLQ在腫瘤中的表達

TIMER2.0分析結果顯示，與正常組織相比，POLQ在包括頭頸部腫瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC，P=6.25e-19)在內的19 種腫瘤中呈較高水平表達，僅在部分乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma, BRCA)腫瘤亞型中無明顯變化及在皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)中下調，提示POLQ高表達是促進大多數腫瘤發生發展的重要因素(圖 1)。

圖 1 TIMER2.0分析腫瘤與正常組織之間的POLQ差異表達

2.2 POLQ干擾對SACC-83細胞增殖及克隆形成能力的影響

本課題通過研究靶向抑制POLQ對SACC-83細胞的影響，探討POLQ作為治療SACC新靶點的可能性。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，與對照組SACC-83細胞相比，POLQ干擾組SACC-83細胞增殖能力被抑制。兩組細胞生長曲線隨培養時間延長而呈現逐漸上升的趨勢，但與對照組相比，POLQ干擾組的生長曲線上升相對平緩(圖2A)。平板克隆實驗結果顯示，對照組及POLQ干擾組克隆形成數目分別為133.33±27.78及48.00±9.80個。與對照組相比，POLQ干擾組形成的克隆數目降低(圖 2B)。

圖 2 CCK-8細胞增殖實驗及平板克隆實驗檢測POLQ干擾對SACC-83細胞增殖(A)及克隆形成能力(B)的影響

2.3 生物信息學預測結合POLQ啟動子的轉錄因子及 FOXM1靶向結合位點預測

用Cistrome數據庫Toolkit模塊預測出的可能性最大的前20 個轉錄因子中(http://dbtoolkit.cistrome.org/?specie=hg38&factor=tf&interval=Chr3%3A121545889-121547988#plot_result)，僅FOXM1(forkhead box M1)既受PTEN負調控，又與DNA修復相關，且POLQ基因啟動子上有5 個FOXM1結合位點(圖 3A)。用AnimalTFDB3.0預測出FOXM1在靶基因啟動子上的特異性結合位點長度為13 bp，特異性結合序列為A/G-A/T-A/C/G-A/C-A/T-C/T/G-A/G-A/C/G-A/T-C-A/T/C-A/C/-C/A(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/#!/tf_gene_info?tf=ENSG00000111206)(圖 3B)。

圖 3 Cistrome預測結合POLQ啟動子的轉錄因子(A)及AnimalTFDB3.0預測FOXM1的特異性結合位點(B)

2.4 FOXM1與POLQ在腫瘤中的表達相關性分析

TIMER2.0分析結果顯示，在包括HNSC在內的39 種腫瘤中FOXM1與POLQ表達水平正相關，僅在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UVM)中二者表達水平無相關關系(圖 4)。

圖 4 TIMER2.0分析腫瘤中FOXM1與POLQ的表達相關性

2.5 PTEN干擾的SACC-83細胞中POLQ與FOXM1的表達

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，PTEN干擾組細胞POLQ與FOXM1基因mRNA的表達上調(圖 5)。

圖 5 qRT-PCR實驗檢測PTEN干擾對SACC-83細胞POLQ與FOXM1表達水平的影響

3 討 論

POLQ基因廣泛表達于正常組織及腫瘤組織中， 促進alt-NHEJ通路中退火產物的延伸[7]。alt-NHEJ修復中，PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase 1)先與DNA斷端結合，POLQ插入核苷酸延伸退火產物。數據庫分析顯示，POLQ在多種腫瘤中表達高于正常組織，提示POLQ高表達是促進絕大多數腫瘤發生發展的重要因素。本課題組前期研究發現POLQ與SACC惡性程度及較差的預后正相關，表明POLQ促進SACC發生發展。本研究證實，POLQ表達降低抑制SACC-83細胞增殖及克隆形成能力。本研究還發現POLQ表達降低促進γH2AX(phospho-histone H2A.X)、ATM(ataxia telangiectasia mutated)以及ATR(ataxia telangiectasia and Rad3 related)表達，并抑制PARP1表達，表明POLQ下調促進DNA雙鏈斷裂、激活DNA損傷應答、抑制alt-NHEJ通路，目前相關結果正在投稿中。以上結果提示POLQ作為SACC治療靶點的可能性。

SACC中PTEN負調控POLQ，且PTEN與POLQ無直接結合，說明有中間因子介導PTEN調控POLQ。DNA聚合酶多由轉錄因子調控，推測POLQ也可能受轉錄因子調節[8-10]。POLQ與DNA修復有關，于是應用Cistrome預測出與POLQ啟動子結合的DNA修復相關轉錄因子FOXM1。FOXM1促進腫瘤發生發展，缺失時可導致非整倍體及DNA斷裂數量的增加，表明FOXM1參與維持基因組穩定性和DNA修復[11-13]。此外，FOXM1受PTEN負調控，并與PI3K/AKT通路正相關[14]。數據庫顯示FOXM1與POLQ在多種腫瘤中表達正相關，且下調PTEN促進SACC-83細胞FOXM1與POLQ表達上調，提示二者可能存在直接調控關系。在未來研究中，可通過雙熒光素酶報告基因實驗明確FOXM1與POLQ的直接調控關系及結合位點。

總之，本課題研究了POLQ對SACC-83細胞的影響，分析了POLQ與FOXM1在多種腫瘤中的表達相關性，首次提出PTEN/FOXM1/POLQ通路存在的可能性，以及FOXM1可能是SACC治療新靶標。