細胞療法治療大便失禁的現狀及展望

陳文斌 李旺林

華南理工大學附屬第二醫院，廣州市第一人民醫院結直腸肛門外科(廣州 510180)

大便失禁是指直腸內容物(氣體、固體或液體糞便)反復不自覺地通過肛門，并且無法推遲排便的癥狀，持續時間至少1個月，發病年齡大于4歲[1- 3]。據報道大便失禁的發病率為0.4%～24%不等，并且隨著年齡的增加，大便失禁的發病率有明顯上升趨勢[4]。分娩、外科手術等原因都可引起大便失禁[5]。大便失禁不僅會導致患者生活質量下降，同時常伴有心理問題的發生和社會負擔加重[6- 7]。目前的治療方案包括保守治療和手術治療，生物反饋、飲食調節、糞便收集等都是常見的保守治療方法[8]。手術治療常用于保守治療無效及肌肉缺損較大的大便失禁。但目前的療效仍不理想，尤其是長期療效和對肛門內括約肌的修復不佳[9-11]。近年來，隨著干細胞及再生醫學的發展，大便失禁的細胞療法廣泛開展，并在動物模型和臨床研究中證實其在大便失禁的修復中發揮積極作用。

1 大便失禁的動物模型及損傷機制

1.1 肛門括約肌損傷模型

目前，大部分研究者構建大便失禁的動物種屬為大鼠[4]，也有研究選擇兔[12- 13]、狗[14- 15]等。主要動物模型包括以下類型：(1)肛門括約肌切開及修復模型[16]：在肛門括約肌復合體上做一7 mm切口，該切口延伸至肛門外括約肌的上緣，縱向長度約為3～4 mm。然后縫合直腸黏膜(間隔1 mm)，第二層采用單純間斷縫合(間隔 1 mm)作為加固層，最外側的肛門外括約肌也需要重新縫合。(2)肛門括約肌復合體25%切除模型[17]：切除腹側25%的肛門括約肌復合體，即10點位到2點位之間的全部括約肌，但文獻中未說明切除的具體長度、體積。(3)50%肛門括約肌復合體切除模型[18]：暴露肛門括約肌復合體，切除括約肌大小為1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，重量為0.5 g。(4)低溫損傷模型[19]：使用液氮冷凍的3 mm直徑鋁棒(單次應用30 s)，對肛門括約肌進行冷凍損傷，范圍為90°扇形區域，24小時內間隔2次進行。(5)陰部神經擠壓模型[20]：采用骶尾部的后側切口入路，在肛門直腸窩處分離出雙側的陰部神經，用Castroviejo針架壓迫2次，每次30 s。其他損傷模型還包括肛門括約肌切開術(sphinctero-tomy，SP)[21- 22]、肛門外括約肌全切術[23]、陰部神經橫斷術[24]等。但是在損傷模型的相關研究中缺乏具體造模步驟或切除括約肌的體積。對于手術部位也存在多種選擇，例如50%肛門括約肌復合體切除模型的損傷區域在左側[25]、腹側中部[18]等部位均有文獻報道。

模型的正確選擇與構建對研究干細胞療法的效果至關重要 ，在不同括約肌損傷程度(肛門括約肌切開、25%括約肌切除、50%括約肌切除)，不同的損傷類型(括約肌外科損傷、冷凍損傷、神經損傷)以及急性、慢性損傷等大便失禁模型中，干細胞療法顯示出令人鼓舞的效果，未來如果能在眾多模型中找到最適合的大便失禁模型，并建立標準建模方法，將在一定程度上促進干細胞對大便失禁療效的相關研究，減少各研究間異質性，促進研究向更深層次拓展。

1.2 大便失禁的損傷機制

正常排便取決于肛門、直腸、肛門內括約肌、肛門外括約肌、恥骨直腸肌以及它們的血管和神經之間復雜的感覺和運動的相互作用，當它們中的一個或多個結構的相互作用被破壞，而其他部分不能代償時就會出現大便失禁[26]。肛門括約肌損傷是大便失禁最常見的病理改變，其中大部分是由于產科疾病導致(30%～40%)，孕婦在分娩時會陰部的撕裂、牽拉、缺血以及會陰切開術等可能導致括約肌損傷[4]。此外，肛腸外科手術也可導致括約肌損傷進而引起大便失禁[5]。

2 干細胞的來源和修復機制

2.1 干細胞來源

在大便失禁的研究中使用的干細胞物種來源廣泛，包括大鼠、兔、狗以及人等，其中常見的干細胞類型包括骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)、成肌細胞、脂肪干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC)，同時神經干細胞、骨髓單核細胞(bone marrow mononuclear cells， MNC )等也有研究報道[6]。骨髓間充質干細胞在動物實驗中通常來源于股骨和脛骨骨髓[27- 29]，剔除股骨周圍肌肉和結締組織，沖洗骨髓腔培養純化后獲取，而骨髓干細胞在臨床研究中尚未開展。成肌細胞在動物實驗中的來源包括腓腸肌[19, 30]、后肢[14, 31- 34]等肌肉豐富部位，在臨床研究中主要來源于胸大肌[10]。采集脂肪組織進行脂肪干細胞原代提取時，采集部位主要集中于腹部和腹股溝皮下，也有研究者在臂部、內臟和大網膜等部位采集脂肪[25, 35- 39]。神經干細胞通常來源于腸道神經元[40]，骨髓單核細胞來源于骨髓組織[16]。

2.2 干細胞的修復機制

干細胞療法治療大便失禁的機制仍不清楚，其多向分化潛能、免疫調節、分泌功能、促進血管生成等特性或許在治療中發揮著重要作用[41]。干細胞具有很大潛力的分化能力主要是通過體外實驗驗證的，在體內實驗鮮有文獻報道，但在Bisson等人[19]的研究中發現注射后的成肌細胞可在體內轉化為成熟肌纖維[19]。同時干細胞可以通過多種途徑參與免疫反應，例如MSC可以通過旁分泌、細胞-細胞間接觸、細胞外囊泡調節免疫反應[42- 43]。干細胞還可以發揮旁分泌作用刺激鄰近組織細胞，Nakamura等人[44]發現MSC可以分泌外泌體通過促進肌肉和血管生成促進肌肉再生，這少部分由miRNAs，例如miR- 494介導。

3 臨床前研究

目前大便失禁的干細胞療法相關研究日益增多，且向著更加深入和完善方向發展，但是正如Gras[45]所說，不同干細胞療法之間缺乏共識。成肌細胞、骨髓間充質干細胞常被選擇用于相關研究，脂肪間充質干細胞由于其來源廣泛、免疫原性差，近年來的研究也不斷增多[12, 25, 37]。

常見的干細胞治療注射方式包括局部肌肉注射和靜脈注射，研究表明兩種治療方式對大便失禁都有積極作用，但在不同研究中二者療效仍存在較大差異。Sujatha等人[28]的研究表明直接注射而不是靜脈注射間充質干細胞可改善損傷后括約肌的收縮功能，并增加了轉化生長因子-1和賴氨酸氧化酶的表達，促進肛門外括約肌的基質沉積。Salcedo等人[20]的結果卻與上述的研究相反，即靜脈注射組和局部注射組可以明顯改善肛門括約肌靜息壓和肌電圖(electromyography，EMG)頻率，但是局部注射組相比靜脈注射組未能改善肛壓峰值以及EMG幅度，這表明靜脈注射的療效可能要優于局部注射組。最近Li等人[46]的研究與上述研究的結論都不相同，作者發現局部注射組與靜脈注射組在改善肛壓基礎值方面沒有明顯差異，但是局部注射組相比于靜脈注射組明顯改善了肛壓峰值、EMG頻率、振幅，Massion染色結果也表明局部注射組在傷口部位有更多的新生肌肉。Salcedo等人的研究[20，47]結果表明，靜脈注射組和肌肉注射組均可以促進括約肌功能恢復，而且靜脈注射組的疤痕組織比肌肉注射更少，但是肌肉注射或許是更可取的方法，因為其需要的細胞量更少。雖然兩種注射方式對大便失禁的療效優劣尚存在爭議，但大部分已發表文獻表明局部注射組可能優于靜脈注射組，這可能是不同研究間造模方式、動物種屬、細胞量、細胞制備方法等多因素導致的。

干細胞療法在促進損傷肛門括約肌功能恢復中表現出可觀的療效，但是由于干預措施、治療周期等的不同，實驗結果存在較多分歧，如能否促進神經損傷的修復。Lane等人[48]通過肛門會陰切開術造模，在成肌細胞治療2周后，肌電圖頻率、振幅等方面與對照組相比有明顯改善，治療4周后，各組均恢復至基線水平，無明顯差異。Salcedo等人[20]使用SP模型模擬外陰切開術，陰部神經壓迫模型模擬分娩導致的神經損傷，間充質干細胞治療后，SP模型的肛門壓力及肌電圖得到明顯改善，而陰部神經壓迫模型沒有改善，我們猜測造模方式可能影響神經修復效果。Li等人[46]的研究表明，在MSC治療后7天、14天以及28天，靜脈注射組的肌電圖振幅和頻率與假手術組沒有明顯差異，但是局部注射組肌電圖振幅及頻率出現明顯改善，這表明注射方式的不同也可影響神經修復。Oh等人[15]通過切除狗的25%肛門括約肌構建大便失禁模型，并使用自體肌細胞進行治療，肛壓及肌電圖結果顯示能改善肛門括約肌功能。肌電圖是評價損傷后神經及其支配肌肉修復情況的重要指標，許多研究中對于干細胞能否促進損傷后肌電圖振幅及頻率等的恢復仍不一致，這種差異的原因是多方面的，例如造模方式、干細胞種類、治療時間、注射方式等，由于神經支配在肌肉收縮中的重要作用，探究干細胞療法對神經修復的作用是有必要的。

干細胞種類豐富，不同干細胞有其獨特的優勢和作用機制，例如脂肪干細胞來源廣泛，成肌細胞可向肌纖維分化。比較不同干細胞對大便失禁的療效對選擇最佳干細胞類型和指導臨床應用具有重要價值。Mazzanti等人[16]比較了骨髓單核細胞和骨髓間充質干細胞的療效，相比生理鹽水組，干細胞治療組明顯改善了肌肉再生，并提高了SR后肛門括約肌的收縮能力。兩種骨髓干細胞類型之間沒有顯著差異，即MNC與MSC在修復肛門括約肌損傷方面同樣有效。本團隊最近的研究比較了局部注射MSC、ADSC和基質血管組分(cellular stromal vascular fraction，CSVF)對大便失禁的療效，結果顯示治療后第5天CSVF組的肌電圖振幅和頻率明顯高于PBS組，而MSC組和ADSC組卻沒有明顯增高。第10天時MSC、ADSC、CSVF組的肛壓和肌電圖明顯改善，并且新生組織中肌肉比例明顯高于PBS組，三者之間沒有統計學差異，即三者對大便失禁的修復效果相同(雖然第10天ADSC和MSC組的肛壓基礎值和肌電圖頻率趨勢上高于CSVF組，但沒有統計學差異)。不同干細胞類型間療效比較的研究較少，尤其是成肌細胞、神經干細胞等細胞之間的比較尚缺乏，并且已發表文獻僅為臨床前研究證據，缺乏臨床研究證據探索不同干細胞間療效優劣。

4 臨床研究

近年來干細胞治療肛門括約肌失禁的臨床研究也顯示出令人鼓舞的結果。 Boyer 等人[49]的一項研究共納入24名大便失禁的患者，患者接受自體成肌細胞(autologous myoblast，AM)或安慰劑治療后，中位克利夫蘭失禁(Cleveland Clinic Incontinence，CCI)評分在治療6個月后與基礎值相比有明顯下降，12月后，AM治療組的中位CCI評分與對照組相比明顯下降，并且反應率明顯高于對照組。Frudinger的研究[50]將自體成肌細胞注射到EAS損傷區域，治療后1個月和6個月，肛門壓力明顯上升，12月后Wexner失禁評分下降，糞便失禁生活評分(faecal incontinence quality of life, FIQL)明顯改善。隨后2015年Frudinger等人[51]為觀察成肌細胞治療后的長期治療效果又納入10名婦女[51]，納入標準與之前的研究相同，結果顯示隨著時間延長Wexner失禁評分持續改善，排便頻率減少，肛門靜息壓和收縮壓持續改善，并且生活質量總體提高。2018年Frudinger等人[10]又探究了在更大目標人群中成肌細胞的治療效果，結果表明擴大目標人群后成肌細胞仍然具有明顯效果，每周大便失禁次數、FIQL評分明顯改善，Wexner失禁評分和大便失禁嚴重程度明顯下降。 Sarveazad等人[39]的研究表明ADSC對大便失禁患者的治療效果不理想，所有患者在實施括約肌成形術后，實驗組和對照組分別給予ADSC和PBS治療，2個月后實驗組與對照組的Wexner評分增加值沒有顯著差異，然而ADSC治療組的EMG和病變區的肌肉比例明顯增加。de la Portilla等人[38]也對ADSC治療大便失禁的療效進行探索，結果表明這種治療是安全的，但未能證明能改善患者的情況。成肌細胞不僅在短期內有明顯效果，在更長時間和更大目標人群中也明顯改善了大便失禁患者的生活質量，然而兩項脂肪干細胞治療大便失禁的臨床研究卻未表現出明顯優勢，還需要進一步探索。

5 結論與展望

大便失禁的動物模型種類多樣，可模擬不同因素導致的大便失禁，同時可選擇的干細胞類型豐富，臨床前研究中最常使用的干細胞為骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、成肌細胞。但是在臨床研究中成肌細胞和脂肪干細胞更為常見，骨髓干細胞尚未用于臨床研究。但對于干細胞治療大便失禁的具體機制不清，不同研究間干細胞來源、制備方法、造模方式等缺乏規范化管理。

大量研究表明，細胞療法在治療大便失禁方面具有很大潛能，能明顯提高患者預后，促進肛門括約肌功能恢復。雖然臨床研究仍較少，未來需要更大樣本、更加深入的研究探索，但細胞療法的似乎是安全、可耐受的。