組蛋白H3K79 甲基化轉移酶DOT1L 的功能研究進展

陳曉晴，陳亮

（武漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430072）

組蛋白的翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）是細胞調控染色質功能的常見表觀遺傳機制之一，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等.這些PTM 可以通過改變染色質結構或招募相應下游功能蛋白來影響基因表達、DNA 復制等染色質活動.其中，組蛋白甲基化是以S-腺苷-L-蛋氨酸（S-Adenosyl methionine，SAM）作為供體，由組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase，HMT）將1 個、2 個或3 個甲基轉移到組蛋白的賴氨酸或精氨酸殘基的過程.

Dot1（disruptor of telomeric silencing 1，也稱為KMT4）首次在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因篩選中被發現，當其過表達時會導致端粒沉默缺陷.在哺乳動物中，Dot1 保守的同源蛋白是DOT1L（Dot1-like），該酶被認為是組蛋白H3 賴氨酸79 的唯一催化酶，能使H3K79 發生單甲基化、二甲基化和三甲基化[1].通常，將DOT1L 介導的H3K79 甲基化與活躍基因轉錄聯系起來.最近研究顯示，DOT1L參與調控細胞周期進程和免疫應答反應，在生物體多種組織或器官發育中具有必不可少的作用，而其異常調控則與腫瘤發生與發展（如MLL基因重排白血?。┟芮邢嚓P.目前，針對DOT1L 開發的小分子抑制劑已在癌癥的早期臨床實驗中取得初步結果.

1 DOT1L 的催化活性及其調控機制

2002 年，Feng[2]等首次在人細胞中鑒定出DOT1L 蛋白，該蛋白在體外和體內具有組蛋白甲基轉移酶活性，能特異性催化組蛋白H3K79 位點的單、二或三甲基化修飾.2003 年，Min[3]等通過X 射線晶體衍射法解析出DOT1L 位于1-416 氨基酸殘基的催化結構域結構，包括碳和氮末端結構域.兩者通過碳末端的長α螺旋和氮末端的氨基酸殘基發生相互作用.

此外，Worden[4]等發現DOT1L 對底物核小體而非核心組蛋白或重組組蛋白H3 具有酶催化活性，表明DOT1L 催化H3K79 甲基化需其他組蛋白參與.在人類細胞中，DOT1L 催化功能依賴組蛋白H2B 賴氨酸120（H2BK120）的單泛素化，H2BK120 的突變導致H3K79 甲基化水平顯著下降.此外，組蛋白H4 氮末端的短堿性口袋與DOT1L 酸性口袋間的相互作用也為H3K79 甲基化所必需.2019 年，Worden[4]等通過冷凍電鏡技術解析了組蛋白H2B 泛素化和H4 尾部與DOT1L 催化H3K79 甲基化的動態過程.DOT1L 與H2B-Ub核小體和SAM 的結合存在2 種不同狀態，暫?；蚧钴S狀態.在暫停狀態下，H2B 泛素分子和由組蛋白H2A、H2B 形成的核小體酸性口袋與DOT1L 碳端結合，將DOT1L 碳端錨定在核小體上，而DOT1L 氮端處于動態無序狀態，導致DOT1L 的活性位點距離H3K79 過遠.在活躍狀態下，DOT1L 氮端的溝槽和H4 尾部的堿性殘基（15-19）結合，將DOT1L 氮端固定在核小體另一端，最終使DOT1L 及其催化中心準確定位在H3K79上方，保證該殘基的識別特異性.活躍狀態下的DOT1L 促進核小體內部H3K79 正亮氨酸環發生約90°旋轉，遠離核小體表面并暴露H3K79 位點于DOT1L 催化中心.

除了H3K79，DOT1L 還催化其他底物，如前列腺癌中雄激素受體（androgen receptor，AR）K349 位的甲基化[5].

2 DOT1L 的生物學功能

2.1 DOT1L 與轉錄調控

通常，認為真核生物H3K79 甲基化與基因活躍轉錄相關.在人CD4+T 細胞中，染色質免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-Seq）顯示H3K79me2/me3 與基因活性呈正相關.在小鼠細胞中，H3K79 甲基化被發現定位在活躍轉錄基因體內，且其富集水平與基因表達水平正相關[6].相反地，在小鼠腎臟中，Reisenauer[7]等發現編碼上皮Na+通道亞基的αENaC基因表達被H3K79 甲基化抑制.DOT1L 缺失影響基因表達，且大部分基因顯示表達上調，但這些影響源于DOT1L 蛋白自身還是H3K79甲基化修飾，是直接還是間接調控目前尚無定論.

最近研究顯示，DOT1L 與人類細胞中的轉錄延伸存在相關性.DOT1L 與RNA 聚合酶II（RNA polymerase II，RNAPII）碳末端重復結構域（C-terminal domain，CTD）、超延伸復合物（super elongation complex，SEC）亞基ENL、AF4、AF9、AF10 發生相互作用.RNAPII CTD 的Ser5 和Ser2 磷酸化修飾分別對應RNAPII 在啟動子起始轉錄和進入有效轉錄延伸階段.SEC 可以通過磷酸化RNAPII CTD 調控RNAPII 從基因啟動子近端暫停位點釋放進入轉錄延伸.另外，ENL 的敲低降低了全基因組H3K79me2 水平及轉錄延伸活性[8]49-50，這些證據暗示DOT1L 在轉錄延伸中的作用.通過BruDRB-seq 測量全基因組轉錄延伸速率發現，轉錄起始區的H3K79me2 水平與轉錄延伸速率正相關[9].DOT1L 調控特定基因的轉錄延伸可能不依賴H3K79 甲基化，因為突變DOT1L 催化活性位點未觀察到轉錄延伸速率的改變[10].DOT1L/H3K79 甲基化修飾對轉錄延伸的作用及機制有待進一步研究.

2.2 DOT1L 在細胞周期調控中的作用

細胞周期是單向且不可逆的過程，確保細胞分裂的正常進行.研究發現，DOT1L 參與調控哺乳動物細胞周期轉換.在人肺癌細胞和小鼠卵黃囊衍生的紅系祖細胞中，DOT1L 敲低或缺失會導致G1 期阻滯[11-12].在體外分化的小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）中，DOT1L 缺失引起細胞增殖缺陷并阻滯在G2/M期[13].在結直腸癌細胞中，DOT1L 沉默或抑制則誘導細胞S 期阻滯[14].DOT1L 敲低或缺失造成不同細胞的差異影響可能與細胞周期中H3K79 甲基化水平相關.如在小鼠ESC 中，G1/S 轉換期H3K79 甲基化水平變化不大，但在人肺癌細胞中H3K79me2 水平明顯升高，這暗示DOT1L 可能通過H3K79me2 調控肺癌細胞G1/S 期轉換[15].此外，盡管H3K79 甲基化的整體水平在細胞周期中沒有波動，但其在特定染色質區域的局部水平變化也可能是細胞周期調控差異的原因.

DNA 損傷引發細胞周期停滯，相應的DNA 修復機制被啟動以確保細胞周期進程的順利進行.DOT1L及其介導的H3K79 甲基化參與DNA 損傷修復過程.2004 年，Huyen[16]等發現人DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）修復蛋白53BP1 與H3K79me2 結合并被招募到DSB 處，H3K79 位點的突變、DOT1L 的缺失以及53BP1tudor 結構域的突變都抑制了53BP1 向DSB 的募集.此外，DOT1L 也在紫外線輻射（ultraviolet，UV）引發的DNA 損傷修復及烷化劑引起的跨損傷合成（translesion synthesis，TLS）修復中發揮重要作用[8，17].鑒于DOT1L/H3K79 甲基化修飾與轉錄活動密切相關，其在DNA 損傷修復中的作用是否有轉錄活動參與值得未來研究.

2.3 DOT1L 在免疫應答中的作用

最新多項研究顯示，DOT1L 調控免疫系統T 淋巴細胞的分化和功能.在條件性敲除T 淋巴細胞DOT1L的小鼠模型中，Scheer[18]等發現胸腺和脾臟中的CD4+T 細胞數量顯著減少，且細胞凋亡增加.此外，DOT1L缺失還激活T 細胞受體（TCR）信號傳導通路，降低TCR 負調節因子CD5 的表達，促進CD4+T 細胞的活化.初始CD4+T 細胞在遇到抗原后可以分化成不同的T 輔助（T helper，Th）細胞亞群，包括產生干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的Th1 細胞、產生白細胞介素（interleukin，IL）-4/5/13 的Th2 細胞和產生IL-17的Th17 細胞.敲除DOT1L 導致CD4+T 細胞中IFN-γ表達升高，產生這種結果是因為DOT1L 缺陷型Th2和Th17 細胞重編程為表達Th1 相關基因（IFN-γ）的細胞.另外，在抑制Th1 分化的轉錄因子基因上發現H3K79me2 水平下降.這些證據表明，DOT1L 可能通過抑制Th1 基因和激活負調節因子來控制Th1 分化.DOT1L 缺失會損害體內Th2 反應，暗示DOT1L 抑制劑在治療Th2 導致的過敏性疾病中的可行策略.

DOT1L 在B 淋巴細胞介導的體液免疫反應中也具重要作用.Kealy[19]等發現，敲除B 細胞的DOT1L，小鼠骨髓和脾臟B 細胞數量減少.此外，特異性敲除成熟B 細胞的DOT1L 會導致流感病毒感染后的記憶B 細胞缺失以及骨髓漿細胞減少.研究表明，DOT1L 為生發中心（germinal center，GC）形成和產生有效GC 反應所必需.在流感病毒感染后，DOT1L 缺陷下調B 細胞信號傳導和遷移相關基因的表達，導致活化的BCL6+B 細胞未能定位在卵泡內形成GC，產生偏向于Th1 細胞的IgG1 或Th2 細胞的IgG2c 抗體明顯減少[20].總之，這些結果顯示DOT1L 是體液免疫反應的調控蛋白.

除了調控T 和B 淋巴細胞的功能，DOT1L 還被報道參與流感病毒感染后的抗病毒反應.Marcos-Villar[21]等發現，敲低DOT1L 或抑制其酶活性損害了核因子NF-κB 入核，下調NF-κB 誘導的IFNβ、IFN 刺激基因56（ISG56）和干擾素誘導蛋白Mx1表達，最終促進流感病毒復制.DOT1L 對病毒復制的影響依賴IFN 信號傳導通路，因為DOT1L 抑制干擾素誘導病毒（如水皰性口炎病毒）增殖，但不改變非干擾素誘導的呼吸道合胞病毒擴增[22].這些證據支持DOT1L 或H3K79 甲基化在調節干擾素誘導病原體抗病毒反應中的作用.

2.4 DOT1L 在機體發育中的作用

DOT1L 在心臟和血管生成中發揮重要作用，DOT1L 缺失會導致胚胎死亡和心血管缺陷.Nguyen[23]等發現，特異性敲除小鼠心臟DOT1L 引起抗肌萎縮蛋白基因下調，出現心室擴張和收縮障礙.此外，有研究表明，DOT1L 通過與轉錄因子ETS-1 協同作用刺激基因Vegfr2表達，促進血管生成[24].DOT1L 在紅細胞生成方面也有重要作用，DOT1L 敲除的小鼠胚胎表現嚴重貧血和骨髓細胞不足.DOT1L 促進紅細胞分化可能通過激活Gata2和抑制骨髓轉錄因子PU.1 實現[12]4488-4489.研究發現，DOT1L 在小鼠軟骨形成過程中高表達，在小鼠軟骨細胞中敲低DOT1L 會導致軟骨形成受損.另外，在敲低細胞中Wnt 靶基因表達下調，顯示DOT1L 可能通過調控Wnt 信號通路促進軟骨形成[25].DOT1L 是淋巴管發育和功能的調節蛋白，Tie2（+）內皮細胞（endothelial cells，ECs）中DOT1L 的缺失下調H3K79me2 水平并抑制與發育和組織功能相關的重要基因表達，引起皮膚水腫、血液-淋巴混合、淋巴瓣和血管發育不全[26].綜上，DOT1L 在維持機體正常發育中具有重要作用，提示運用DOT1L 抑制劑治療時可能出現發育相關的并發癥.

3 DOT1L 與MLL-r 白血病

急性白血病是最常見的癌癥之一，也是兒童癌癥死亡的主要原因.急性白血病主要包括急性淋巴細胞白血病和急性髓細胞白血病，染色體易位是導致2 種白血病發展的主要機制之一，最常見的是混合譜系白血病基因（Mixed Lineage Leukemia，MLL）易位.MLL基因的易位重排導致MLL 氮端與多種融合伴侶（>90個）碳端融合，產生的融合蛋白與DNA 或染色質結合，并在造血干細胞和祖細胞中誘導白血病轉化.研究發現，DOT1L 及其介導的H3K79me2 在MLL-r 白血病中發揮重要作用.DOT1L 通過與MLL 融合蛋白（如MLL-AF4，MLL-AF9，MLL-AF10，MLL-ENL）直接或間接作用，被異常招募至MLL 融合靶基因（如Hoxa家族和Meis1）啟動子處，隨后DOT1L 催化的H3K79me2 激活這些基因的轉錄，促進白血病轉化.DOT1L的催化活性是MLL重排白血病發生的驅動因素，因為DOT1L 的酶活缺陷能夠抑制MLL-r 細胞的生長.盡管DOT1L 在疾病本身中沒有發生基因突變，但其錯誤定位的酶活性是致使MLL-r 患者發病的原因之一，這意味著DOT1L 酶活可以作為白血病治療的靶標[27].據此研發出DOT1L 的小分子抑制劑EPZ004777，該化合物通過與DOT1L 甲基轉移酶活性所需的SAM 輔助因子競爭而發揮作用.EPZ004777 能有效抑制細胞H3K79 甲基化，阻斷白血病基因表達并選擇性殺死MLL-r 細胞，但其藥理特性較差.第二代SAM 競爭型抑制劑EPZ5676 是EPZ004777 的衍生藥物，具有更高的底物特異性和效能，目前該藥處于臨床實驗中，但其口服的生物利用率較低，需要腹腔給藥.最近，開發出了新的高效小分子抑制劑SGC0946 和SYC-522，這些藥物正在進行功能和作用機制的研究中[28].此外，一些針對DOT1L 通路的替代藥物和聯合用藥方案也在積極探索中.

4 展望

近年來，因DOT1L 與各種腫瘤的發生、發展密切相關，逐漸成為癌癥預后評估和治療干預的潛在靶點，特別是MLL-r 白血病.目前，已經開發出用以治療MLL-r 白血病的DOT1L 抑制劑，但這些抑制劑普遍存在生物利用率低和快速降解等問題.此外，DOT1L 對機體發育的重要作用也提示靶向DOT1L 的治療方法存在副作用風險.因此，深入探索DOT1L 在不同發育過程和疾病中的作用機制，將有助于開發新的治療方案，如靶向DOT1L 調控蛋白或下游效應蛋白，達到更優的治療效果.