叢枝菌根（AM）真菌擴繁試驗研究

黃 金，肖信錦，王慧娟，鄧揚悟,2

（1.國家離子型稀土資源高效開發利用工程技術研究中心/江西離子型稀土工程技術研究有限公司 江西，贛州341000；2.江西理工大學 江西，贛州 341000）

離子型稀土礦開采早期，主要采用池浸和堆浸工藝，遺留下來了大量廢棄礦區，廢棄礦區的立地條件十分惡劣、生境破碎，動植物基本消失。本課題組利用叢枝菌根真菌（以下簡稱“AM真菌”）+植被修復技術對離子型稀土廢棄礦區進行生態修復，并篩選出了摩西斗管囊霉（簡稱“G.m 真菌”）、根內根孢囊霉（簡稱“G.i 真菌”）兩種AM真菌，對植被在離子型稀土廢棄土壤上生長有較顯著地促進作用。如何獲得大量AM 真菌的菌劑是AM 真菌應用的關鍵，因此，需對AM真菌的擴繁條件進行研究。

AM真菌具有自身不能進行DNA復制的特性，因此到目前為止，這些真菌的純培養尚未取得成功，不能像其他可純培養的微生物一樣通過工業發酵，來進行AM真菌菌劑的大規模工業化應用，現有AM真菌生產方法中宿主植物盆栽培養法是最經濟、可靠、易行的培養方法，因此可借助宿主植物對菌種進行擴大繁殖。在AM 真菌擴繁過程中，宿主植物和培養基質的選擇非常重要。以砂或土為基質較易擴繁AM 真菌，但存在基質成分復雜，需要滅菌處理和接種劑重量大，不便于運輸等缺點，離子型稀土礦山基本都分布在礦山相對偏遠地區，若要大規模應用，理想的菌劑應具有侵染率高、質輕、便于運輸等特點。為生產侵染率高、低成本、質輕的AM真菌菌劑，本試驗以高粱和紫花苜蓿作為宿主植物，分別在以沸石、河砂、珍珠巖、蛭石、草炭土5 種原料組成不同配比的3 種基質中進行培養，探索G.m 真菌和G.i 真菌的最佳擴繁條件，為離子型稀土廢棄礦山菌劑應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

①供試菌種：G.m 真菌和G.i 真菌均購自于北京市農林科學院植物營養與資源研究所“叢枝菌根真菌種質資源庫”（BGC），每盆接種劑量為70g。

②供試植物：高粱、紫花苜蓿種子，均來源于市售，播種前用10%HO滅菌10min 后，清水清洗干凈，再用清水浸泡12h。

③培養基質：試驗設置三種基質，分別為P1（沸石：河砂：珍珠巖：蛭石=1：2：4：3）、P2（沸石：河砂：珍珠巖：蛭石：草炭土=1：2：3：3：1）、P3（沸石：河砂：蛭石：草炭土=1：2：3：4）（其中數字為體積份數），為排除基質攜帶的雜菌對試驗的影響，配制好三種基質后，基質在烘箱中160℃高溫滅菌4h，待自然冷卻備用。

培養基質的的理化性質見表1。由表1 可知，P1 至P3，隨著草炭土含量提高，基質的有機質、總N、堿解氮、總磷、有效P 等均有大幅提升，而總K 和有效K 含量有所降低，pH值也從中性降低到酸性。

表1 不同培養基質理化性質

④試驗器皿

白色塑料花盆，10cm×φ16cm，體積約1350cm，花盆用10%的次氯酸鈣消毒滅菌處理。

1.2 試驗方案

基質對侵染率的影響：以紫花苜蓿作為宿主植物，分別在3種基質上對G.m真菌和G.i真菌進行擴繁，6處理、3平行樣，共18盆。

宿主植物對侵染率的影響：以P2 為培養基質，以高粱為宿主植物對G.m 真菌和G.i 真菌進行擴繁，2 處理，3平行樣，共6 盆。試驗結果與（1）中P2 作為培養基質，以紫花苜蓿作為宿主植物擴繁結果進行對比。

試驗步驟：花盆裝好滅菌基質至3/5 體積處（450g），然后將對應的叢枝菌根菌劑均勻覆于基質上層，再覆蓋一層薄的基質（100g），然后播種對應的宿主種子（紫花苜蓿約50 顆、高粱20 顆），播種完后再覆一層基質（100g）。種子長出幼苗10d 后間苗，高粱留10 株/盆、紫花苜蓿留25 株/盆。前三 周 每 周噴1 次Hoagland 營養液，每次50mL，后續根據培養基質干濕情況進行適量澆水，室內溫度控制在20-28℃，光照時間為14h/d。擴培4個月后檢測植株根系菌根侵染和產孢量，菌根侵染率檢測用墨水醋染色法，產孢量檢測用濕篩傾析法。

2 結果與分析

2.1 培養基質對菌劑擴繁的影響

培養基質的性質決定了水分養分的吸附性能和通氣狀況，從而影響植物根系的生長以及菌根真菌的繁殖。沸石為大顆粒基質，可保證基質有較好的透氣性，河砂可以讓多余的水分走掉，而珍珠巖、蛭石、草炭土等基質質量較輕，有利于運輸，且能提供一定的營養物質。

侵染率是反應AM 真菌在宿主植物根系侵染狀況最重要的指標，侵染率越高，說明其在宿主根系侵染的能力越大，則菌劑質量越好；孢子是AM真菌最重要的繁殖體，孢子的數量可以反映菌劑質量好壞，孢子數量越多，越容易侵染植物根系。以紫花苜蓿作為宿主植物，G.m、G.i兩種AM 真菌在不同培養基質下的侵染率及產孢量見表2。

由表2可知：

表2 培養基質對侵染率和產孢量的影響

三種培養基質下G.m 真菌的侵染率高低次序為P1≈P2＞P3，其中P1基質下侵染率略高于P2，而P3基質下侵染率比P1基質低13.75%，三種培養基質主要的區別為草炭土含量不同，其中P3 基質草炭土含量最高，侵染率最低，可能是因為草炭土能為植物的生長提供營養元素，過高的營養元素供給量反而抑制了叢枝菌根的侵染。從侵染率高低的角度評價，G.m 真菌較好的培養基質是P1或者P2。

三種培養基質下G.i 真菌的侵染率高低次序為P1＞P2≈P3，其中P1 基質下侵染率約是P2、P3 基質下的1.25倍，G.i真菌的適宜培養基質為P1。

G.m、G.i兩種AM真菌在三種培養基質下侵染率和產孢量均表現出了G.i高于G.m，說明G.i真菌比G.m更易侵染紫花苜蓿。

三種培養基質下G.m 真菌孢子數依次為P2≈P1＞P3，其中P3 基質下孢子數僅為P1、P2 的40%，主要是P3基質中含有較高的草炭土含量，能提供較為充沛的營養，而過高的營養則容易抑制真菌孢子的產生，從產孢量的角度看，P2或者P1基質適合G.m真菌。

三種培養基質下G.i 孢子數依次為P2＞P1＞P3 對于G.i真菌來說，適當的養分有助于孢子的產生，但過量的養分會抑制孢子產生。

2.2 不同宿主植物對菌劑擴繁的影響

由于AM真菌的培養條件變化很大，因此可供選擇宿主植物種類很多，一般選用對AM 真菌依賴性較大，對菌種專一性較小，根系發達，且能夠忍受高光照條件的植物種，通常選擇C4 植物和豆科植物，現有文獻報導中已經成功運用的植物種有高粱、三葉草、苜蓿、煙草、蘇丹草等。本試驗采用高粱、紫花苜蓿作為宿主植物在P2基質中進行菌劑擴繁試驗，G.m、G.i兩種AM真菌侵染高粱、紫花苜蓿的侵染率與產孢量分別見圖1、圖2。

圖1 宿主植物對菌根侵染率的影響

圖2 宿主植物對產孢量的影響

由圖1、圖2可知，兩種AM真菌在紫花苜蓿中的侵染率和產孢量都明顯高于高粱，對于G.m真菌，紫花苜蓿的侵染率是高粱侵染率的1.35倍，產孢量是高量的1.19倍；對于G.i 真菌，紫花苜蓿的侵染率是高粱侵染率的1.18倍，產孢量是高量的1.73 倍。因此，兩種AM 真菌最佳的宿主植物為紫花苜蓿。

紫花苜蓿和高粱根系侵染狀況及對照組根系情況見圖3，紫花苜蓿根系絕大部分根段被侵染產生了大量泡囊和少量叢枝結構，而高粱根系則是部分被侵染，產生較多的叢枝和泡囊結構。a)、b)分別為AM 真菌侵染紫花苜蓿和高粱根系；c)、d)分別為空白紫花苜蓿和高粱根系。

圖3 宿主植物根系侵染情況

3 結語

本研究探索了培養基質與宿主植物對AM 真菌擴繁的影響，具有以下結論：

對于同一種培養基質，G.m、G.i 兩種AM 真菌最佳宿主植物均為為紫花苜蓿，其侵染率和產孢量都顯著高于高粱。

培養基質對不同的AM 真菌的擴繁影響不一致。對于G.m 真菌，在P1 和P2 基質下侵染率和產孢量接近，但都明顯高于P3基質，從減少培養基質種類的角度看，可選擇P1基質作為培養基質；對于G.i真菌，P1基質侵染率高于P2 和P3，但產孢量為P1 顯著高于P2、P3，少量的草炭土能為植株和菌根提供適當的營養，綜合看，P2基質更適合G.i真菌的擴繁。