草烏甲素可溶性微針的制備、質量評價及體外透皮性能研究

李銳婷，李麗云，孫文強，丁江生

(1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111)

疼痛是最常見的臨床癥狀之一，全球近三分之一的人口深受疼痛困擾，特別是慢性疼痛，嚴重影響患者的生活質量和工作效率。草烏甲素為毛茛科烏頭屬植物龍頭烏頭(AconitumLongtounenseT.L.Ming)提取分離出來的二萜雙酯生物堿，又叫滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A)。草烏甲素是我國20世紀80年代自主研發的新型第三類鎮痛藥物，不具有耐受性和成癮性，鎮痛作用分別是嗎啡的65倍和阿司匹林的7 000倍，臨床上已廣泛用于治療關節痛和神經病理性疼痛、癌癥晚期疼痛等[1-2]。目前，草烏甲素已上市的劑型有注射劑、片劑和膠囊。草烏甲素因藥效強，毒性大，對黏膜、肌肉等組織具有較強的刺激性，注射給藥時局部會產生劇烈疼痛，使用不方便，口服時首過效應明顯，生物利用度低，胃腸道反應較明顯[3]。

微針(microneedle)是指直徑小于幾十微米、長度為25～2000 μm 的針狀結構[4]，通過刺穿皮膚角質層進行透皮給藥，基本不產生皮膚損傷和疼痛感?？扇苄晕⑨?dissolving microneedle，DMN)是微針中的一類，由水溶性高分子材料制備而成，具有給藥效率高、安全性好、生物相容性好等優勢[5]，現已廣泛用于多種藥物的經皮給藥研究。本文選取草烏甲素為模型藥物，采用正交試驗優選微針的處方及制備工藝，以期獲得具有鎮痛作用的草烏甲素可溶性微針，并對微針的表觀、機械強度、體外釋放、穩定性等進行研究。

1 儀器與材料

1.1 材料 草烏甲素(昆明制藥集團有限公司，批號：20140518)；透明質酸(HA，華熙福瑞達生物醫藥有限公司，批號：1906173)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K30，博愛新開源醫療科技集團股份有限公司，批號：C200210012)；聚乙烯醇1788型(PVA，美國阿拉丁，批號：G1509033)；次甲基藍(上海試劑一廠，批號：20161018)；乙醇為分析醇，乙腈為色譜純，水為實驗室自制超純水。

1.2 主要設備及儀器 低速離心機(TD5A-WS，湖南湘儀離心機儀器有限公司)；真空干燥箱(BPZ-6210LC，上海一恒科學儀器有限公司)；電子天平[1225020258，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；電子天平(EX 125 ZH，奧豪斯儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(DHG-9145A，上海一恒科學儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)；可調移液器(16018203，德國賽多利斯)；數顯推拉力計(HF-50，溫州市海寶儀器有限公司)；測搖式測試臺(HCS-500，溫州市海寶儀器有限公司)；透皮擴散試驗儀(TK-12D，上海鍇凱科技貿易有限公司)；微針模具(ST-05，新加坡Micropoint Technologies)；體視顯微鏡(M205C，德國徠卡公司)。

1.3 實驗動物 SD小鼠，體重200～240 g，雄性，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK (京) 2019-0008，合格證號：1103221911011030。

2 方法與結果

2.1 微針的制備

2.1.1 基質填充方法篩選 采用模具分層澆筑法制備可溶性微針，主要分為兩步，第一步：將含藥物的基質填充至模具針尖部分，除去模具表面多余的針尖基質，干燥1 h；第二步：填充背襯基質，干燥固化即得微針。本試驗開展了離心法和真空法填充基質的對比研究。

采用離心法填充基質時，在3 000～4 000 r·min-1條件下離心10～20 min下，基質溶液能充分進入模具針尖部分，干燥后制得的微針陣列針形完整，且無大量氣泡產生；采用真空法填充基質時，抽真空至10 Pa，當基質濃度較高時，抽真空會使基質產生大量氣泡，致使基質溶液不能完全進入模具針尖部分，制得的樣品針尖不完整。

因此，制備可溶性微針時采用離心法(3 500 r·min-1，10 min)對基質溶液進行填充。

2.1.2 基質的篩選

2.1.2.1 單一基質的篩選 根據材料的力學特性，將基質材料分為韌性材料和脆性材料。通常，韌性材料具有較佳的韌性、可塑性，制備的可溶性微針不易碎裂，但機械強度不足，無法刺入皮膚給藥；脆性材料具有較強的硬度，不易發生形變，制備微針的機械強度佳，但給藥時易碎裂。本研究對多種常用制備可溶性微針的基質如PVA、PVP K30、HA、CMC-Na、HPMC等進行篩選，判斷其力學特性，并對其制備微針的情況進行研究。

單一基質的篩選結果如表1所示，脆性材料中HA(分子量為7 kDa)、PVP K30、PVP K90制備可溶性微針的成型性、機械強度較佳；韌性材料中PVA、HPMC制備可溶性微針的成型性、韌性較佳。胡霞[6]研究表明，PVP K90 在高濃度(160 mg·mL-1)時具有一定的細胞毒性，而本研究中PVP K90制備微針的濃度為200～300 mg·mL-1，因此選擇PVP K30、HA(低分子量)作為針尖基質與韌性材料PVA、HPMC進行復合基質的篩選。

表1 多種材料制備可溶性微針的情況

2.1.2.2 復合基質的篩選 為得到機械強度良好、韌性較佳的可溶性微針，本研究將篩選出的脆性材料和韌性材料相結合，篩選制備可溶性微針的最佳復合基質，結果如表2所示。

表2 復合基質的制備微針的情況

結果表明，將PVP K30和HA(7 kDa分子量)混合配成濃度為0.3 g·mL-1的溶液作為針尖基質，濃度為15%PVA作為背襯基質時制備的微針機械強度良好、韌性較佳。

2.1.2.3 基質比例及濃度篩選 根據復合基質的篩選結果，對針尖基質HA和PVP K30的比例進行研究。對HA∶PVP K30的重量比例1∶9、2∶8、4∶6、6∶4進行考察，根據微針貼片的完整度、機械強度選擇HA∶PVP K30為2∶8、4∶6、6∶4作為正交試驗中針尖基質比例的三水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。在分析過程中，多組間的數據比較處理采用One-way ANOVA方法進行分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2.1.3 溶劑種類及濃度的篩選 不同的溶劑對微針的成型性、機械強度、藥物分布等有不同的影響。因草烏甲素不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、稀鹽酸等。為避免制備過程中殘留的溶劑在給藥過程中損害人體健康，本研究選擇毒性較小的乙醇作為溶劑，且乙醇能有效抑制微針中藥物向背襯層擴散[7]。分別考察了35%、45%、60%、75%的乙醇溶液對微針成型性的影響，結果表明，微針的成型性、機械強度隨乙醇濃度的升高而降低，因此選擇溶劑乙醇濃度35%、45%、60%作為正交試驗的三水平。

2.1.4 干燥溫度的篩選 微針貼片制備過程中，干燥溫度會影響微針的成型性、機械強度、制備周期等。溫度過高時，干燥過程中容易產生氣泡，且制備的微針貼片較脆、易碎；溫度低容易造成干燥時間長、延長了制備周期。本試驗對干燥溫度25、35、45、55 ℃進行考察，結果表明隨干燥溫度的升高微針的完整度、機械強度會降低，但25 ℃時所需干燥時間過長。因此選擇35、45、55 ℃作為正交試驗中干燥溫度的三水平。

2.1.5 正交試驗 根據篩選結果，采用L9(34)正交試驗，對針尖基質HA∶PVP K30比例(A)、干燥溫度(B)、溶劑濃度(C)進行考察，以微針表征、機械強度、易脫模程度、干燥時間等綜合評分為標準設計正交試驗(見表3)，自制評分標準見表4，正交結果見表5，方差分析見表6。

表3 L9 (34)正交設計

表4 可溶性微針的評分標準

表5 制備空白微針的正交試驗安排與結果

表6 微針綜合評分方差分析結果

極差分析顯示，各因素中針尖基質比例(A)對微針的綜合評分影響最大，因素影響順序為A>C>B。方差分析顯示，因素A對微針的綜合評分具有顯著性影響(P<0.05)。根據試驗結果得出，制備可溶性微針的最佳工藝處方為 A2B1C2，即針尖基質HA∶PVP K30=4∶6，干燥溫度35 ℃，溶劑濃度為45%。

2.1.6 草烏甲素可溶性微針的制備 根據篩選的最佳處方，將草烏甲素原料藥與針尖基質(HA∶PVP K30=4∶6)溶解混合，制成載藥量為150、100、70 μg的草烏甲素可溶性微針。

2.2 微針的質量評價

A.測量微針貼片的大??；B.微針貼片；C.顯微鏡下的微針照片圖1 草烏甲素可溶性微針的表觀

2.2.2 微針機械強度

2.2.2.1 穿刺試驗 將鋁箔平鋪，草烏甲素可溶性微針針尖向下放置，在一定壓力下按壓，觀察微針穿刺鋁箔的孔隙率和穿刺后微針的形態，鋁箔紙厚約24 μm。取脫毛處理后的離體豬皮膚，用含次甲基藍的微針穿刺豬皮，醫用膠布固定，處理5 min后除去微針貼片，觀察皮膚表面及微針的形態。

穿刺結果如圖2所示，草烏甲素可溶性微針可刺穿鋁箔，在鋁箔上留下完整的穿刺孔道，穿刺后微針基本保持完整，針尖部分出現略微彎曲情況；離體豬皮上，微針形成了與微針陣列相一致的點狀分布，表明微針機械強度良好，可順利穿刺皮膚。

A.微針貼片穿刺鋁箔的正面；B.微針貼片穿刺鋁箔的背面；C.含次甲基藍的微針貼片刺穿豬皮圖2 可溶性微針貼片刺穿鋁箔、豬皮的情況

2.2.2.2 壓力-位移研究 本實驗室自行組裝對微針機械強度進行測試的儀器，將數顯推拉力計(HF-50)固定在側搖式測試臺(HCS-500)上，通過手搖測試臺實現拉力計的上下運動，根據微針在不同壓力下的位移情況考察微針的機械強度。測試時選用直徑為5 mm的探頭，勻速下降，壓力與位移的曲線圖如圖3所示，當位移達550 μm時，每針承受的力達0.222 N，壓力移除時大部分微針針型完整，表明機械強度良好。

圖3 操作示意圖及位移-壓力曲線圖

2.2.3 微針的體外溶解釋放情況 將含量為70 μg草烏甲素可溶性微針溶解于10 mL 35%的乙醇中，分別在0.5、1、2、4、5、6、8 min取樣0.8 mL并立即補充相同體積的新鮮溶液。樣品經0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測定藥物釋放量，HPLC法測定草烏甲素的色譜條件根據《中國藥典》[8]規定進行。結果表明，草烏甲素可溶性微針在35%的乙醇溶液中8 min時釋放量達98.83%，釋放曲線如圖4所示。

圖4 草烏甲素可溶性微針在體外的溶解釋放情況

2.3 微針體外透皮釋放情況 取健康SD小鼠，脫頸椎處死，小心去除腹部的毛，剝離皮膚，用手術刀刮去皮下組織，并用異丙醇多次擦拭去除剩余的皮下脂肪和筋膜，用生理鹽水反復清洗，濾紙吸干水分，-20 ℃的冰箱中保存。

取直立式雙室Franz擴散池(擴散面積為1.766 cm2，接收池容積為7 mL)進行微針(載藥量為70 μg)體外透皮釋放研究，考察不同比例的生理鹽水-無水乙醇接收液中草烏甲素可溶性微針中藥物體外透皮情況。微針貼片貼在處理過的皮膚上，拇指持續按壓2 min，醫用膠帶固定后，將皮膚夾在擴散池的供體室和接收池之間，用角質層側與接收溶液接觸，排盡皮膚下的空氣，蓋上固定蓋，用夾子固定好避免漏液，磁力攪拌速度設定為500 r·min-1，(37.0±0.5)℃恒溫水浴。通過取樣針在預定時間點(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h)取樣0.8 mL并立即補充相同體積的新鮮接收液。樣品經0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測定藥物滲透量。根據下列公式1計算單位面積累積滲透量，考察不同接收液中載藥微針的釋放情況，每個時間點取5份樣品藥物釋放量的平均值，結果如圖5所示。

圖5 不同接收液中草烏甲素體外透皮的單位面積累積滲透量情況(n=5)

(公式1)

Qn為第 n 個取樣點草烏甲素的單位面積累積滲透量(μg·cm-2)，Cn為第 n 個取樣點草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，Ci為第i個取樣點樣品中草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，S為擴散池截面積(cm2)，V0為接受室體積(mL)，V為取樣體積(mL)。

結果表明，草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放在24 h內藥物的釋放量達到較高水平，然后慢慢趨于平穩。草烏甲素可溶性微針在接收液40%生理鹽水+60%無水乙醇中釋放量最高，24 h時釋放率達84.67%，單位面積累積滲透量為33.56 μg·cm-2；48 h時釋放率達96.41%，單位面積累積滲透量為38.22 μg·cm-2。

對草烏甲素可溶性微針體外釋放量最高的曲線進行3種釋放模型擬合，結果如表7所示，從數據可以看出，一級方程的R2值為0.997 2 ，為3種擬合方程中最高的，由此可見草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放符合一級方程的釋放規律。

表7 接收液4的釋放曲線在3種模型的曲線擬合

3 討論

基質材料對微針的制備至關重要，其力學特性會影響微針的成型性、機械強度等。單一基質的篩選中發現，同一物質，分子量不同，材料的力學特性不同，如透明質酸鈉(HA)基質，當分子量大于10 000時，材料為韌性材料，可塑性強；當分子量小于10 000時，材料為脆性材料，制備的微針機械強度佳。

經穩定性研究發現，微針在高溫環境中儲存對會產生不良反應。高溫環境中，密封儲存的草烏甲素可溶性微針會由透明狀態變為微黃色，且部分藥物會向背襯層擴散，載藥量越高，擴散越明顯。載藥量為150、100 μg的微針會在背襯層形成藥物聚集的白色斑點，載藥量為70 μg的微針在背襯層不會形成明顯的藥物聚集斑點。常溫環境下，密封儲存的草烏甲素可溶性微針的表征、機械強度基本保持不變，少量藥物會向背襯層擴散，但不會在背襯部分形成藥物聚集的斑點。因此，草烏甲素可溶性微針儲存時應避免處于高溫狀態，以免造成藥物向背襯層的流失。

微針體外透皮釋放研究中，不同的接收液中微針的體外透皮釋放情況不同。理論上接收液中無水乙醇含量越高，透皮釋放量越多，但結果卻與之有一定差異，這可能由于離體鼠皮部位的不同、角質層厚度不同、離體皮膚的處理差異、微針貼片間載藥量存在差異等因素造成。

本研究以大分子藥物草烏甲素作為模型，采用分層澆筑法制備草烏甲素可溶性微針，因藥物處于針尖部分，因此可精確控制載藥量。正交法優選制備微針的最佳工藝，制成的微針表征良好、針形完整，機械強度良好、韌性較佳，能成功刺穿鋁箔，刺入皮膚以實現藥物的有效滲透。草烏甲素可溶性微針作為草烏甲素的給藥新劑型，能安全、有效、快速、方便地進行經皮給藥，本研究能為其后續開發利用提供一定依據。