不同腧穴配伍治療失眠模型大鼠效應機制差異的研究

馮志濤，邱占爽，王之虹

（長春中醫藥大學，長春 130117）

失眠是指患者入睡困難或多夢易醒導致睡眠質量差、睡眠時間少進而表現出日間疲勞、思睡、厭食的一種主觀癥狀[1]。針刺治療失眠具有起效快、無不良反應等特點，然而臨床中不同的醫家治療原發性失眠（胃氣失和型）的腧穴配伍差異性很大，胡幼平教授重視辨證選穴，以中脘、足三里配伍為主；王富春教授重視辨病選穴，以百會、三陰交、神門配伍為主；導師王之虹教授重視辨證結合辨病選穴，以百會、三陰交、神門、足三里、中脘配伍為主；臨床中3種腧穴配伍治療失眠均可起到良好的療效。為明確3種腧穴配伍之間效應機制的差異及針刺治療失眠的最佳選穴方法，本實驗以PCPA致大鼠失眠模型為研究對象，選取大鼠血清中胃動素（MTL）、胃泌素（GAS）、5-羥色胺（5-HT）、褪黑素（MT）為客觀研究指標，以期提供客觀的證據支持臨床中針刺治療失眠的選穴依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 50只Wister大鼠，健康，雄性，SPF級，2月齡，體質量（200±20）g，長春中醫藥大學提供[動物許可證：SCXK（吉）-2020-002]。實驗室內溫度調控在20～26 ℃、濕度60%～80%、室內光照按照白晝交替、按時攝食、自由攝水，適應7 d后分為空白組（n=10），造模組（n=40），造模結束后將造模組隨機分模型組（n=10）、辨證選穴組（n=10）、辨病選穴組（n=10）、辨證結合辨病選穴組（n=10）。

1.2 主要試劑與儀器 試劑：PCPA（美國 Sigma，CAS號：103616-89-3），戊巴比妥鈉 上海化學試劑公司提供（F20180816），大鼠MTL 試劑盒（長春市弘揚科技有限公司提供，批號：20201356），大鼠GAS試劑盒（長春市弘揚科技有限公司提供，批號：20201378），大鼠5-HT試劑盒（吉林省博創科技有限公司，批號：20205623），大鼠MT試劑盒（吉林省博創科技有限公司，批號：20203412）。

儀器：一次性無菌針灸針（0.25 mm×25 mm，長春愛康醫療器械有限公司），自動酶標分析儀（賽默飛世爾儀器有限公司），低溫高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 失眠模型 采用國內外公認的腹腔注射PCPA造模法建立失眠大鼠模型[2]，具體操作如下：將0.9%生理鹽水中加入碳酸氫鈉片調成弱堿性（pH值7.0～8.0）水溶液，將PCPA研磨成細粉按照1 mL/100 mg配制成混懸液備用，臨用前用自動平衡離心機震蕩搖勻；每日上午8:00－8:30根據大鼠體質量（400 mg/kg）對造模組大鼠進行腹腔注射，空白組給予腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續注射2 d。

1.4 治療方法 治療組包括辨證選穴組：中脘、足三里；辨病選穴組：神門、三陰交、百會；辨病結合辨證選穴組：足三里、中脘、神門、百會、三陰交，取穴具體位置及針刺操作規范參照《實驗針灸學》[3]。造模完成后第2天早上8:00－9:00對治療組失眠大鼠抓摸后針刺，留針1 min，只捻轉不提插，平補平瀉手法，連續治療7 d；模型組和空白組不做任何治療，給予相同的抓摸時間，共7 d。

1.5 觀察指標及檢測方法 翻正實驗：造模完成后12 h及末次治療后根據大鼠體質量腹腔注射戊巴比妥鈉（按照50 μg/mL配比，溶于0.9%生理鹽水中，給藥劑量35 mg/kg），檢測睡眠潛伏期及睡眠時間，將大鼠仰臥位放置于平板上，若大鼠在60 s內不翻動，可視為翻正反射消失，給藥到翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期；繼續記錄時間直至大鼠自動翻動身體且在60 s內不再將身體翻轉過去的時間為睡眠時間。

ELISA法檢測大鼠血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量，末次治療結束后，腹腔注射10%的水合氯醛（3 mL/kg），大鼠麻醉后腹主動脈取血4 mL，分別置于EP管中，做好組別標記后，放入冰塊中冷藏，隨即將EP管放入離心機中，3 000 r/min，離心10 min，取出EP管，用移液槍吸出離心后的上層血清100 μL，放入-20 ℃冰箱保存備用。分別按試劑盒說明書檢測血清中MTL、GAS、5-HT和MT的含量。向預先包被了MTL、GAS、5-HT和MT單克隆抗體的酶標孔中加入MTL、GAS、5-HT和MT溫育；溫育后，加入生物素標記的抗MTL、GAS、5-HT和MT抗體，再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和反復洗滌，去除未結合的酶，加入顯色液，避光溫育，最后加入終止液，用多功能微孔板測讀儀測定MTL、GAS、5-HT和MT的吸光度（A）值。將A值和標準品濃度建立標準方程，利用樣本A值結合標準方程求得MTL、GAS、5-HT和MT的濃度[4]。

1.6 統計學處理 數據采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 不同腧穴配伍組對失眠模型大鼠睡眠時間、睡眠潛伏期結果的影響 第1次腹腔注射PCPA造模36 h后，對大鼠進行翻正實驗，與空白組相比，造模組睡眠潛伏期明顯延長（P＜0.01），睡眠時間顯著縮短（P＜0.01），見圖1。造模組大鼠煩躁、多動、晝夜節律紊亂，說明造模成功，將造模組（n=40）大鼠隨機分為模型組（n=10）、辨證選穴組（n=10）、辨病選穴組（n=10）、辨證結合辨病選穴組（n=10）。針刺治療7 d后，辨證、辨病、辨證結合辨病選穴組與模型組相比，睡眠潛伏期明顯縮短（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），睡眠時間明顯延長（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）；其中與辨證、辨病選穴組相比，辨證結合辨病選穴組的睡眠潛伏期縮短（P＜0.05），睡眠時間延長（P＜0.05），見圖2。

圖1 空白組與造模組大鼠睡眠潛伏期(SL)和睡眠時間（ST）比較

圖2 各組大鼠睡眠潛伏期（SL）和睡眠時間（ST）比較

2.2 不同腧穴配伍組對失眠模型大鼠血清GAS、MTL、5-HT和MT含量的影響 與空白組相比，模型組血清中GAS、MTL、5-HT和MT的含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，辨證、辨病、辨證結合辨病選穴組血清中GAS、MTL含量明顯增加（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05），其中與辨病、辨證結合辨病選穴組相比，辨證選穴組血清中MTL、GAS含量增加明顯（P＜0.05），見圖3；與模型組相比，辨證、辨病、辨證結合辨病選穴組血清中5-HT、MT明顯增加（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01），與辨證、辨病選穴組相比，辨病結合辨證選穴組血清中5-HT、MT含量增加明顯（P＜0.05），見圖4。

圖3 各組大鼠胃泌素（GAS）和胃動素（MTL）比較

圖4 各組大鼠5-羥色胺（5-HT）和褪黑素（MT）比較

3 討論

腧穴配伍是在選穴原則的基礎上根據病癥選取有效的穴位，是針灸處方中重要組成部分，為針灸治療疾病提供方案的選穴方法[5]。臨床中不同醫家治療失眠的腧穴配伍差異性很大，胡幼平教授治療失眠時重視調理脾胃，調暢氣機，以“胃不和則臥不安”為選穴依據，重視辨證選穴，臨床中治療原發性失眠（胃氣失和型）處方中多以中脘、足三里配伍為主，并提出“和胃安神”針法治療失眠[6]，中脘、足三里為合募配穴，中脘能使胃容性擴張，足三里促進胃腸蠕動[7]，二穴配伍和胃、降氣、安神，胃和則臥安；王富春治療失眠重視辨病選穴，臨床中治療原發性失眠（胃氣失和型）處方以百會、三陰交、神門配伍為主，并提出“鎮靜安神”針法治療失眠[8]，百會位于巔頂，深系腦髓、調節一身陰陽，神門、三陰交寧心和胃，三穴配伍可和胃降氣、寧心安神，使陽氣趨緩，入陰則寐[9]；王之虹重視辨證結合辨病選穴，臨床中治療原發性失眠（胃氣失和型）處方以百會、三陰交、神門、足三里、中脘配伍為主；王之虹提出主癥選主穴，辨證選配穴，增效協同，運用同功穴的腧穴配伍理論，針對原發性失眠的主癥選用百會、神門、三陰交為主穴，具有鎮靜安神之功，針對胃氣失和證型，配伍中脘、足三里，具有和胃安神之效，以期協同增效，目前在臨床中，導師運用辨病與辨證選穴治療原發性失眠（胃氣失和型）療效確切；3種腧穴配伍選穴理論依據充分，臨床中療效均得到認可，但3種腧穴配伍效應機制的差異還不清楚。

失眠與胃腸功能障礙關系密切，流行病學證實在失眠患者的伴隨癥狀中脾胃功能紊亂發生率高達69.19%[10]，現代醫學認為消化系統與神經系統之間的相互作用是通過腦腸軸雙向調節腦腸肽含量而實現[11]。參與調節神經系統和消化系統的腦腸肽有20余種，主要包括胃泌素（GAS）、胃動素（MTL）、5-羥色胺（5-HT）、褪黑素（MT）。GAS具有增強胃動力、延緩胃排空等作用，MTL可通過增強胃動力調節晝夜節律的紊亂[12]，有實驗報道正常大鼠睡眠剝奪后血清中GAS、MTL的含量變化明顯[13]，由此證明GAS、MTL具有調節睡眠節律紊亂的作用；5-HT在胃腸道和中樞神經系統中分布密集，主要參與調節胃腸蠕動及相關激素分泌的同時又有調節睡眠－覺醒周期的作用[14-15]，研究證明5-HT對調節睡眠－覺醒周期發揮重要作用，可通過調節與睡眠相關物質GAGB、Glu、TNF-α的含量調控睡眠－覺醒周期[16]；MT主要分布于胃腸道和中樞神經系統中，具有調節睡眠－覺醒周期、誘導睡眠的作用[17]，MT具有保護胃黏膜完整性、促進潰瘍愈合、升高胃泌素含量等作用。

本實驗研究結果證明，腹腔注射PCPA可導致大鼠睡眠潛伏期顯著延長、睡眠時間明顯縮短、血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量顯著降低；辨證、辨病、辨證結合辨病選穴均可縮短失眠大鼠睡眠潛伏期、延長睡眠時間、增加血清中MTL、GAS、5-HT、MT含量，其中辨證選穴組血清中MTL、GAS含量增加明顯，證明辨證選穴主要通過提高MTL、GAS的含量而改善睡眠；辨病結合辨證選穴組血清中5-HT、MT含量增加明顯，證明辨證結合辨病選穴通過提高5-HT、MT的含量而改善睡眠。

綜上，3種腧穴配伍選穴法的效應機制是通過提高血清中MTL、GAS、5-HT、MT的含量、延長睡眠時間、縮短睡眠潛伏期而改善失眠大鼠的睡眠質量，對失眠具有調治作用；綜合3種腧穴配伍對失眠大鼠睡眠潛伏期、睡眠時間及MTL、GAS、5-HT、MT含量的影響支持辨病結合辨證選穴為針刺治療失眠的最佳腧穴配伍方法。