槲皮素對病毒性腦炎幼鼠癥狀的緩解及對TLR9通路的調節作用研究

閆宇嬌，王德莉，石對先

（河南中醫藥大學第五臨床醫學院/鄭州人民醫院，鄭州 450000）

病毒性腦炎（viral encephalitis，VE）是一種常見于兒科的感染性中樞神經系統急癥[1]。該病因病毒種類以及侵犯部位的不同，臨床表現呈多樣化，主要為頭痛、嘔吐、抽搐、發熱、運動功能障礙、意識模糊等[2]。目前臨床對病毒性腦炎尚無有效的治療方法，通常采取控制發熱、炎癥，降低免疫反應損傷，防止呼吸衰竭等措施，但效果并不理想，且其臨床特征不明顯，易被誤診延誤治療，以致預后不佳，致殘率、病死率居高不下[3]。因此，探尋療效更加確切的病毒性腦炎治療方式，對于改善病毒性腦炎預后意義重大。槲皮素是慢性支氣管炎常用藥物，也可用于冠心病、高血壓的輔助治療，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、免疫抑制、抗病毒等功效[4]。本研究通過建立病毒性腦炎幼鼠模型，研究槲皮素對病毒性腦炎的治療作用，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級雄性BALB/c幼鼠50只，3周齡，體質量（9.45±0.45）g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，生產許可SCXK（滬）2017-0004。槲皮素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司），柯薩奇病毒B3懸液（武漢博威德生物技術有限公司），Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）9/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）信號通路激動劑CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN）（上海易匯生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、鈣結合蛋白（S100 calciumbinding protein B，S-100B）酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），兔抗小鼠TLR9、MyD88、核轉錄因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）、p-NF-κB蛋白一抗（美國R&D公司）。CX23光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），iMark酶標儀、Gel Doc XR凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），TY-80電泳儀（南京普陽科學儀器研究所）。

1.2 建立病毒性腦炎模型[5]從50只BALB/c幼鼠中隨機抽取10只作為對照組，其余建立病毒性腦炎模型。乙醚麻醉后，在右側眼角與耳根連線中點進針2～3 mm，顱內注射30 μL 100 TCID50 10-3病毒濃度，對照組同位置注射同體積生理鹽水。將建模幼鼠隨機分為模型組（13只）、槲皮素組（13只）、槲皮素加激動劑組（14只）。實驗結束后觀察腦組織病理變化，以出現明顯病理改變為建模成功。剔除建模失敗幼鼠數據及實驗過程中死亡幼鼠數據，模型組、槲皮素組建模失敗2只，死亡1只，槲皮素加激動劑組建模失敗2只，死亡2只，最終各組均納入10只。

1.3 干預[6-7]建模完成后，槲皮素組灌胃槲皮素生理鹽水溶液1 mL（含藥量100 mg/kg），腹腔注射生理鹽水0.6 μg/g，槲皮素加激動劑組灌胃槲皮素生理鹽水溶液1 mL（含藥量100 mg/kg）后腹腔注射CpG ODN 0.6 μg/g，對照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，腹腔注射生理鹽水0.6 μg/g。每天1次，持續7 d。

1.4 組織取材 末次干預后，各組幼鼠禁食禁水6 h，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，抽取腹主動脈血注入離心管內，3 000 r/min離心15 min，取其上清，置于液氮中保存，后脫頸處死幼鼠，摘取腦組織，分成3份，1份用4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，經病理切片機制作為厚度4 μm連續切片用于HE染色；兩份置于液氮中保存用于ELISA實驗及蛋白檢測。

1.5 檢測腦組織炎癥指標TNF-α、IL-1β水平 取液氮保存的腦組織，剪碎后加入PBS 1 mL，注入預冷玻璃勻漿器中，充分研磨，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），取其上清，采用ELISA法檢測腦組織中TNF-α、IL-1β水平，按照ELISA試劑盒說明書要求設計實驗步驟，經酶標儀測定波長570 nm位置吸光度值，通過標準曲線計算TNF-α、IL-1β濃度。

1.6 檢測血清神經功能指標IFN-γ、S-100B水平 取液氮保存的主動脈血清，采用ELISA法檢測血清中IFN-γ、S-100B水平，按照ELISA試劑盒說明書要求設計實驗步驟，經酶標儀測定波長570 nm位置吸光度值，通過標準曲線計算IFN-γ、S-100B濃度。

1.7 HE染色觀察腦組織病理學改變 取腦組織切片常規脫蠟，自來水沖洗，加入蘇木精液染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇沖洗3 s，自來水沖洗，加入Scott藍化液反藍，自來水沖洗，伊紅液染色，梯度乙醇脫水、透明，滴入中性樹膠封片，光鏡下觀察腦組織病理學變化，并拍照記錄。

1.8 Western blot法檢測腦組織TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達 取液氮保存的腦組織研磨器研磨，加入PBS洗滌勻漿，置于離心管中，注入RIPA裂解液裂解，8 500 r/min離心15 min（離心半徑8 cm），經BCA試劑盒定量蛋白。取40 μg樣品與上樣緩沖液1:5體積比混合，沸水浴5 min，離心取其上清，恒壓80 V行上樣電泳分離，改110 V濕法轉膜，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗小鼠TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗（1:500），4 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1:2 000），常溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發光液顯色，暗室曝光，經凝膠成像系統掃描拍照，分析灰度值，以TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對表達量。計算p-NF-κB p65/NF-κB p65。

1.9 統計學處理 采用SPSS 19.0對數據進行分析與處理，采用均數±標準差（x±s）描述計量資料，采用單因素方差分析比較多樣本計量資料，以LSD-t檢驗比較兩兩樣本。

2 結果

2.1 行為學觀察 對照組幼鼠未見行為學異常；建模后幼鼠接種病毒后陸續出現活動量減少、蜷縮、毛發松散、食欲減輕等表現，3 d后出現肢體麻痹、抽搐、耳廓尾部壞死等表現，4只幼鼠死亡，槲皮素組、槲皮素加激動劑組干預后上述癥狀均有所改善。

2.2 炎癥指標水平 與對照組比較，模型組腦組織TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組腦組織TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；與槲皮素組比較，槲皮素加激動劑組腦組織TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠腦組織炎癥指標水平比較（，n =10）ng/mL

表1 各組幼鼠腦組織炎癥指標水平比較（，n =10）ng/mL

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與槲皮素組比較，▲P＜0.05

2.3 神經功能指標IFN-γ、S-100B水平 與對照組比較，模型組血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組血清IFN-γ、S-100B水平降低（P＜0.05）；與槲皮素組比較，槲皮素加激動劑組血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠腦組織神經功能指標水平比較（，n =10）

表2 各組幼鼠腦組織神經功能指標水平比較（，n =10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與槲皮素組比較，▲P＜0.05

2.4 HE染色觀察腦組織病理學改變 HE染色結果顯示，對照組幼鼠腦組織神經元結構正常；模型組幼鼠腦組織明顯水腫，大量神經細胞壞死，神經元樹突消失、細胞核染色重，炎性細胞大量浸潤；槲皮素組、槲皮素加激動劑組幼鼠腦組織水腫程度減輕，神經元少量變性，炎性細胞少量浸潤，槲皮素組病理改善程度更為明顯。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組腦組織病理變化（×400，標尺25 μm）

2.5 腦組織TLR9、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 與對照組比較，模型組腦組織TLR9、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組腦組織TLR9、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低（P＜0.05）；與槲皮素組比較，槲皮素加激動劑組腦組織TLR9、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）。見圖2，表3。

圖2 Western blot法檢測腦組織TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

表3 各組腦組織TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達（，n =10）

表3 各組腦組織TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達（，n =10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與槲皮素組比較，▲P＜0.05

3 討論

病毒性腦炎是由于腦實質被各種病毒侵犯而引發的急性炎癥疾病，其病情與患者的免疫狀態關系密切，智力降低、癱瘓、癲癇等預后不良后遺癥頻發[8]。皰疹病毒、小腸病毒、日本腦炎病毒、巨細胞病毒均是病毒性腦炎的常見病原體，我國流行病調查研究顯示，小腸病毒是病毒性腦炎最常見的病因[9]。目前病毒性腦炎發病機制尚不明確，通常認為與灰質炎癥反應及免疫介導損傷有關[10]。盡管西藥可在一定程度上保護病毒性腦炎腦損傷，但由于藥物自身療效的局限性及不良反應，臨床應用受到一定限制。隨著對祖國醫學研究的逐步深入，相對安全的中藥及其單體成分逐漸應用于病毒性腦炎治療中。

IFN-γ是輔助T1樣細胞、自然殺傷細胞活化后產生的單糖蛋白，可間接活化巨噬細胞、中性粒細胞，增強其吞噬能力及抗病毒能力，是機體重要免疫調控因子，常用來作為神經功能損傷標記物[11]。S-100B是腦組織膠質細胞分泌的高度保守的鈣結合蛋白，在機體中樞神經系統中廣泛分布，其會在腦組織損傷時溢出，進入腦脊液及血液中，是判斷腦損傷程度的特異性指標之一[12]。槲皮素是提取自殼斗科、小檗科、金絲桃科植物皮葉的黃酮醇類化合物，在植物界廣泛分布，是一種天然抗氧化劑，國外常被用于治療前列腺癌[13]。有研究表明[14]，槲皮素通過抑制小膠質細胞衍生的氧化應激反應和炎癥反應，有效減輕小鼠腦梗塞體積及認知、運動功能缺陷，提示其對腦損傷的治療作用。本研究結果顯示，與模型組比較，槲皮素組腦組織TNF-α、IL-1β水平、血清IFN-γ、S-100B水平降低，HE染色結果顯示，與模型組比較，槲皮素組腦組織水腫程度減輕，神經元變性、炎性細胞浸潤減少，提示槲皮素可降低腦組織炎癥反應，減輕神經功能損傷及腦組織病理學變化。

TLR9/MyD88信號通路是機體經典炎癥反應通路。TLR9是模式識別受體蛋白，廣泛分布于多種細胞膜及細胞內，參與介導機體先天及特異性免疫[15]。MyD88是其下游轉接蛋白，TLR9與相關損傷因子配體結合后，激活MyD88蛋白，通過信號傳導刺激NF-κB，其磷酸化后轉移至細胞核，誘導巨噬細胞、單核細胞合成并釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子，促進炎癥反應發生[16]。Zhou等[17]研究認為，抑制TLR9信號通路可下調腦組織炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組腦組織TLR9、MyD88蛋白表達量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高，經槲皮素干預后均降低，且在槲皮素基礎上增用TLR9/MyD88信號通路激動劑CpG ODN可減弱槲皮素對病毒性腦炎的治療作用，提示TLR9/MyD88信號通路在病毒性腦炎中異常激活，槲皮素可能通過抑制該通路對病毒性腦炎幼鼠產生治療作用。

綜上所述，槲皮素可緩解病毒性腦炎幼鼠癥狀，減輕炎癥反應及神經功能損傷，推測其作用機制與抑制TLR9/MyD88信號通路有關。