疏肝解郁湯對大鼠急性乳腺炎的抑制效果與機制研究

馬曉佳，楊璐妍，黃冬涵，李本發，黃 敏

（1.云南省中醫醫院/云南中醫藥大學第一附屬醫院，昆明 650000；2云南中醫藥大學，昆明 650000）

乳腺炎屬于乳房化膿性炎癥，是一種最常見的乳腺疾病，主要特征為乳腺水腫，組織內皮和上皮完整性破壞，多發生于女性產后哺乳期，由病原微生物感染所致[1-2]。MAP激酶（MAPK）信號通路與p38蛋白在炎癥反應的調控中發揮著關鍵作用[3-5]。有研究報道磷酸化p38蛋白參與了金黃色葡萄球菌誘導小鼠乳腺炎和肺炎的形成[6]。因為臨床上乳腺炎多由細菌感染引起，所以抗生素治療成為了治療急性乳腺炎的主要方法[7]。但長期廣泛使用抗生素會導致病原菌產生耐藥，也易導致炎癥組織機化遺留冷性僵塊，遷延難愈，逐漸成為制約乳腺炎治療的瓶頸。

中醫將急性乳腺炎歸屬于“乳癰”范疇，在用藥治療方面積累了豐富的經驗[8]，多治以清熱解毒、通乳散結，具有療效好，不良反應少等優點[9]，記載于《醫宗金鑒》的瓜蔞牛蒡湯屬于治療乳癰經典名方，具有清熱散邪、疏肝解郁等作用，多用于早期乳癰[10-11]。疏肝解郁湯在瓜蔞牛篣湯的基礎上進行重新組方，既加強了疏肝清胃通乳的功效，又避免了原方過于寒涼，易形成冷性僵塊的弊端。本科室使用疏肝解郁湯數年，臨床療效顯著，患者獲益頗豐，但詳細機制不明，因此本研究從“疏肝解郁”方面探究重組方劑對乳腺炎的治療效果及其機制，為治療乳腺炎的提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級SD雌性孕期大鼠，8～10周齡，體質量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189。疏肝解郁湯方劑組成：全瓜蔞15 g，炒柴胡10 g，牛蒡子15 g，重樓10 g，蒲公英15 g，制香附10 g，炒青皮10 g，郁金10 g，陳皮10 g，玫瑰花5 g，絲瓜絡10 g，鹿角霜10 g。將藥物在清水中浸泡0.5～1 h，煎取2次，第一次為0.5 h，第二次為0.3 h，混合兩次藥液，濃縮過濾至1 g/mL，冷藏備用，由云南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，給藥時使用生理鹽水進行稀釋。大鼠IL-1、IL-6、TNF-α免疫酶聯試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司。p38、p-p38、β-actin抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司。MAPKAPK2、p-MAPKAPK2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。SpectraMAX Plus384酶標儀（美谷分子儀器有限公司）；STM7顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；JY-SCZ4+垂直電泳槽、JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；5200化學發光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要實驗方法

1.2.1 LPS大鼠乳腺炎模型構建及藥物干預[12]大鼠分娩后泌乳第5～7天，隨機分為空白組、模型組、疏肝解郁中藥湯劑低劑量組（2.5 mg/kg）、疏肝解郁中藥湯劑中劑量組（5 mg/kg）、疏肝解郁中藥湯劑高劑量組（10 mg/kg），每組10只。與幼鼠隔離1 h后，將疏肝解郁中藥湯劑分別稀釋為0.125、0.25、0.5 mg/mL，給藥容積為20 mL/kg，進行灌胃，空白組和模型組灌胃生理鹽水，每天1次，持續5 d。末次灌胃1 h后腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）進行麻醉，取仰臥位置于體視顯微鏡下，乙醇消毒第4對乳頭并使其充分暴露，鑷子固定乳頭，用眼科剪剪去乳頭尖端處，暴露乳導管，然后用微量注射器緩慢插入乳導管并灌注LPS（0.2 mg/mL），空白組灌注生理鹽水，停留數秒后再緩慢抽出針頭。12 h后各劑量組再次灌胃疏肝解郁湯，空白組和模型組灌胃相同劑量的生理鹽水。LPS刺激24 h后腹腔注射戊巴比妥鈉（0.6 g/kg）麻醉后進行頸椎脫臼處死大鼠，采集指標供后續測定。

1.2.2 乳腺組織病理學檢測 乙醇消毒后使用解剖剪剪開大鼠腹部皮膚，使第4對乳腺組織充分暴露，剝離乳腺組織放置在4%多聚甲醛中固定過夜，各組標本進行脫水處理后制作石蠟切片，HE染色后使用顯微鏡在100、400倍放大倍數下觀察乳腺組織病理學變化。

1.2.3 Elisa 檢測收集各組動物血液與乳腺組織，血液經離心后收集上層血清。乳腺組織制成10%組織勻漿液，離心后收集上清液，按Elisa試劑盒說明書分別測定血清與組織中IL-1、IL-6與TNF-α的含量。

1.2.4 Western Blot 收集各組乳腺組織，加入組織裂解液在冰上進行蛋白質提取，同時進行蛋白定量。定量后加入Loading Buffer后97 ℃水浴10 min進行蛋白變性，在4 ℃下保存備用。按30 μg蛋白進行凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，轉膜后在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，轉移至一抗中4 ℃過夜孵育，TBST清洗3遍后室溫孵育二抗2 h，TBST清洗3遍后進行ECL化學發光，在凝膠成像系統中觀察條帶，并進行拍照與灰度值分析，以β-actin作為內參，計算蛋白表達水平。

1.3 統計學分析 使用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。所有數值均采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠乳腺組織影響 觀察發現，空白組大鼠乳腺組織中乳腺小葉結構較為明顯，周圍腺泡數量較多，無明顯壞死或炎細胞浸潤；模型組大鼠乳腺組織導管部分上皮細胞壞死脫落于管腔內，部分細胞崩解，胞核固縮、碎裂或溶解消失，管腔內可見桿狀核中性粒細胞等炎細胞浸潤；疏肝解郁湯低劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結構清晰，葉間間隙小，周圍腺泡數量較多，導管少量上皮細胞壞死，胞核溶解，管腔內可見少量炎細胞浸潤，少量腺泡上皮細胞壞死；疏肝解郁湯中劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結構清晰，葉間間隙小，周圍腺泡數量較多；導管少量上皮細胞空泡變性，管腔可見少量的淋巴細胞浸潤，部分腺泡上皮細胞空泡變性，腺泡腔內少量的淋巴細胞浸潤；疏肝解郁湯高劑量組大鼠活動期乳腺組織乳腺小葉結構清晰，周圍腺泡數量較多，導管結構完整，無明顯壞死及炎細胞浸潤；少量腺泡上皮細胞空泡變性。具體見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織變化情況（HE染色，放大倍數100、400倍）

2.2 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠血清與乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α的影響 結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清與組織中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均升高（P＜0.01）；與模型組相比，疏肝解郁湯高劑量組血清與組織中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均降低（P＜0.05），疏肝解郁湯中劑量組血清與組織中IL-1、組織中IL-6含量降低（P＜0.05），疏肝解郁湯低劑量組雖有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），具體結果見表1、表2。

表1 各組動物血清中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

表1 各組動物血清中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各組動物乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

表2 各組動物乳腺組織中IL-1、IL-6、TNF-α變化情況（，n =10） pg/mL

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 疏肝解郁湯對乳腺炎大鼠乳腺組織中p38、p-p38、MAPKAPK2與p-MAPKAPK2蛋白表達的影響 與空白組相比，各組大鼠乳腺組織中p38與MAPKAPK2蛋白表達水平無變化（P＞0.05），其中模型組p-p38與p-MAPKAPK2蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，疏肝解郁湯高、中、低劑量組p-p38蛋白表達水平降低（P＜0.01），高劑量組p-MAPKAPK2蛋白水平下降（P＜0.05），中、低劑量組p-MAPKAPK2無明顯變化（P＞0.05），具體見圖2。

圖2 各組大鼠乳腺組織蛋白表達水平變化情況

3 討論

LPS能誘導機體產生急性炎癥反應，因此被用于構建多種動物乳腺炎模型中[13-15]。本實驗通過病理學觀察發現模型組乳腺組織中存在大量中性粒細胞等炎性細胞聚集的情況，符合乳腺炎的癥狀[16-17]，說明動物乳腺炎模型構建成功。而使用疏肝解郁湯后，乳腺組織中腺泡數量與導管結構開始恢復，中性粒細胞與淋巴細胞消失，說明疏肝解郁湯具有緩解乳腺組織病變效果。

IL-1是一種炎癥介質，具有IL-1α與IL-1β兩種亞型[18]。IL-1β被外來抗原刺激后分泌量急劇增加；IL-6是一種多功能細胞因子，參與免疫反應與急性期炎癥反應[19]；TNF-α是TNF家族的促炎癥成員，在組織損傷、內毒素刺激和感染時產生[20-22]。已有研究證實，減少促炎細胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的產生可以降低乳腺炎的影響[23]。本實驗使用疏肝解郁湯后，組織與血清的炎癥因子含量降低，結合病理學觀察發現組織的炎癥癥狀開始消失，乳腺炎得到好轉，高劑量效果最好，由此說明疏肝解郁湯可能通過減少炎癥因子產生起到抗炎效果。

MAPK信號通路廣泛參與機體的炎癥和應激反應，并提供關鍵的抗炎藥物靶點[24]。MAPKAPK2是MAPK通路的下游表達產物，參與調控炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，主要由p38調控激活[25]。本研究發現，LPS誘導的乳腺炎可以促進p38與MAPKAPK2蛋白的磷酸化激活，使炎癥因子的分泌增多（P＜0.05）；給藥后p38與MAPKAPK2蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05），說明疏肝解郁湯可能通過抑制p38/MAPKAPK2通路產生抗炎的作用。

本方對瓜蔞牛蒡湯進行重新組方并添加了重樓，現代藥理研究表明，重樓皂苷具有消炎、鎮痛、止血、抗感染的效果[26]，加味后疏肝清胃通乳的功效更上一層樓。炒青皮、制香附、郁金、玫瑰花有疏肝理氣的效果，絲瓜絡有通乳消癰的療效，陳皮和胃散結，鹿角霜運用其中，防止寒涼過重使腫塊難消，形成冷性僵塊。數藥合用共奏疏肝解郁，清熱消癰之效。

綜上所述，疏肝解郁湯具有抗炎消癰的效果，能減少LPS誘導的大鼠乳腺炎乳腺組織的炎癥反應，降低血清與組織中的炎癥因子，作用機制可能是抑制p38/MAPKAPK2通路。