外源褪黑素對鹽堿脅迫下小黑麥種子萌發幼苗生長、抗氧化能力的影響

左月桃，董 玲，任曉松，劉趙月，左師宇，李 晶

(東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱150030)

中國鹽堿地面積大，約為3 600萬hm，可耕地中鹽堿地面積占總耕地面積的20%以上。鹽堿脅迫會破壞植物光合中心，抑制電子傳遞，加速葉綠素含量降解，降低光合速率和降養分吸收能力，嚴重影響植物生存和生長。

小黑麥(L.)是通過小麥()和黑麥()雜交、人工培育的新物種，具有雜種生長優勢、營養品質好、抗逆性強、適應性廣和產量高的特點，已成為糧、飼、經兼用新型作物。褪黑素(melatonin)又稱松果腺素，是一種在動物、植物、真菌和細菌中廣泛存在的吲哚胺類小分子物質。褪黑素在植物體內含量極低，有調節植物生長、提高抗氧化能力等功能。研究表明，外源褪黑素可增強植物對冷熱脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫的耐受性，緩解逆境對植物造成的傷害。外源褪黑素能夠有效緩解葉綠素含量的流失，具有延緩葉片衰老、促進光合的作用。干旱條件下，外源褪黑素可提高大豆、小麥光合同化能力和抗氧化酶活性，減少細胞膜損傷，增加抗旱能力和產量。在鹽堿脅迫下，施用褪黑素能夠有效保護黃瓜幼苗的光合反應中心，提高光能轉化率，增強其光合作用，促進幼苗生長；降低離子毒害，改善植株體內離子養分的動態平衡；有效抑制葉片在鹽堿脅迫下活性氧產生，提高保護酶及抗氧化酶的活性，減輕過氧化物對細胞膜的傷害，從而增強植株的抗鹽堿性。褪黑素在蘋果和番茄上有與黃瓜幼苗相同的效果。抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環是活性氧清除機制的重要途徑之一，其效率的提高是外源褪黑素增強植物抗逆性的一個主要原因。鹽堿條件下，油菜及其近緣種和不同種源黑果枸杞的種子萌發指標均顯著降低。關于外源褪黑素對小黑麥抗低氮、低溫、干旱等脅迫能力的影響研究已有報道，且對鹽脅迫抗性的影響研究在水稻等作物上也有所開展，但就外源褪黑素對小黑麥抗鹽堿脅迫能力的影響尚未見報道。本研究以小黑麥品種東農96026為試驗材料，分析了外源褪黑素對鹽堿脅迫條件下小黑麥種子萌發、幼苗形態、抗氧化酶系統及生理特性的影響，以期為小黑麥抗鹽堿栽培提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小黑麥品種為東農96026，由東北農業大學農學院麥類育種課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 發芽試驗

人工挑選籽粒飽滿均勻一致的小黑麥種子，用清水沖洗3次，經10%次氯酸鈉(NaClO)消毒浸泡15 min，再用蒸餾水充分沖洗3次后浸種18 h后，置于培養皿(15 cm口徑，底部放兩層濾紙作為發芽床)中，每個培養皿中75粒種子，種子間距為粒長1～2倍。設4個處理組：(1)1/2Hoagland營養液(CK)；(2)褪黑素+1/2Hoagland營養液(MT)；(3)鹽堿溶液+1/2 Hoagland營養液(ST)；(4)褪黑素+鹽堿溶液+1/2Hoagland營養液(SM)。每個培養皿中加入10 mL處理液。其中，褪黑素濃度為預試驗篩選出的最適濃度200 μmol·L；鹽堿混合溶液濃度為25 mmol·L，以NaCl、NaHCO摩爾比 1∶1配成。每個處理3次重復。在25±1 ℃、75%相對濕度的培養箱中催芽，每天更換濾紙和處理液，以保持種子萌發環境滲透勢不變。每天定時記錄種子發芽數(以胚根長度大于2 mm為發芽標準)，在第4 天調查發芽勢，第7 天調查發芽率。萌發結束后取胚芽、胚根測量其鮮重，然后用濾紙把胚芽、胚根、種子分別包裹，依次殺青(于105 ℃烘箱中5 min)、烘干(65 ℃恒溫烘箱)、稱重(取10粒的總重)，計算胚芽與胚根的相對含水量。

種子發芽率=(第7天發芽種子數/供試種子總數)×100%；發芽勢=(第4 天發芽種子數/供試種子總數)×100%;發芽指數=∑(/)，式中為某測定日，為調查種子發芽數時試驗天數的發芽種子數。

1.2.2 水培試驗

選取均勻飽滿的種子用10% NaClO溶液消毒15 min后浸種18 h，瀝干水，取一個托盤底部鋪一張濾紙，灑上水保持紙濕潤，但不可積水，把浸泡好的種子均勻地灑在濾紙上，取一條新的毛巾打濕，覆蓋到小黑麥種子上面，移至25±1 ℃、75%相對濕度的培養箱中催芽，將發芽一致的種子轉移至裝有5 L 1/2 Hoagland營養液(pH值為6.0)的培養盆里培養，每盆定苗108株，光照時長為12 h，溫度為28±2 ℃，光強為4 000 lx，相對濕度為65%～75%，每3 d更換一次營養液，每天用氣泵通氣40 min。至植株長至二葉一心時進行以下處理：(1)1/2 Hoagland營養液(CK)；(2)褪黑素+1/2 Hoagland營養液(MT)；(3)鹽鹽堿混合溶液+1/2 Hoagland營養液(ST)；(4)褪黑素+鹽堿混合溶液+1/2 Hoagland營養液(SM)。為避免SM處理中鹽堿脅迫對小黑麥幼苗產生沖擊，小黑麥二葉一心時先加入褪黑素和Hoagland營養液12 h后，分2次加入鹽堿混合溶液至25 mmol·L，每次加入鹽堿混合溶液間隔為12 h。褪黑素濃度和鹽堿濃度均與發芽試驗相同。

鹽堿脅迫4 d后，各處理隨機取5株長勢一致的幼苗，用直尺測量幼苗高度，并取樣用蒸餾水清洗后，用濾紙吸去水分，稱量地上部分與根系鮮重。將樣品放入烘箱，105 ℃下殺青30 min，在80 ℃下烘至恒重，稱干重。每個處理三次生物學重復。

在鹽堿脅迫1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，每個處理分別選取代表性樣株5株，取幼苗葉片和根系分別進行生化指標測定，每個處理三次生物學重復。其中，可溶性糖和可溶性蛋白質含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍G-250染色法測定；還原型抗壞血酸(AsA)、脫氫抗壞血酸(DHA)含量采用4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(BP)顯色法測定，DHA含量為總抗壞血酸與AsA的差值；還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量采用5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)顯色法測定，GSH含量為總谷胱甘肽與GSSG的差值；單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及谷胱甘肽還原酶(GR)活性采用試劑盒(購自蘇州格銳思生物技術有限公司)測定。

1.3 數據分析工具

采用SPSS和 Microsoft Excel 2013軟件分析試驗數據及繪圖，各個處理間采用 LSD 法進行數據方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對鹽堿脅迫下小黑麥種子萌發的 影響

在4個處理中，褪黑素處理(MT)的小黑麥種子發芽率、發芽勢和發芽指數均最高，與其他處理差異均顯著(表1)，說明外源褪黑素對小黑麥種子萌發具有明顯的促進作用。與CK相比，鹽堿脅迫處理(ST)的種子發芽率、發芽勢和發芽指數均顯著降低，說明鹽堿脅迫明顯抑制了小黑麥種子萌發。在鹽堿脅迫條件下，添加褪黑素處理(SM)較ST處理顯著提高了小黑麥種子發芽率、發芽勢和發芽指數，說明外源褪黑素緩解鹽堿脅迫對小黑麥種子萌發的抑制效應。

表1 褪黑素對鹽堿脅迫下小黑麥種子發芽的影響Table 1 Effect of melatonin on the germination of triticale seeds under salt-alkali stress

2.2 褪黑素對鹽堿脅迫下小黑麥生物量的影響

與CK處理相比，鹽堿脅迫顯著抑制小黑麥的生長，而外源褪黑素影響不明顯(表2)。在鹽堿脅迫條件下，與ST處理相比，添加褪黑素處理(SM)顯著增加小黑麥幼苗高度及地上部和根系生物量，顯著降低根冠比。與CK相比，SM處理的地上部生物量有所下降，但根系生物量、根冠比與CK差異均不顯著，說明外源褪黑素能緩解鹽堿脅迫對小黑麥生長的抑制效應，并能夠促進小黑麥地上部和地下部之間協調生長。

表2 鹽堿脅迫下褪黑素對小黑麥鮮重與干重、株高及根冠比的影響Table 2 Effects of melatonin on fresh weight,dry weight,plant height and root to shoot ratio of triticale under salt-alkali stress

2.3 褪黑素處理對鹽堿脅迫下小黑麥根系可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

隨著鹽堿脅迫時間的延長，小黑麥根系可溶性糖和可溶性蛋白含量整體上呈上升趨勢(表3)。與CK相比，鹽堿脅迫和外源褪黑素均能顯著提高小黑麥根系可溶性糖和可溶性蛋白含量。在鹽堿脅迫條件下，添加褪黑素處理(SM)的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于ST處理，且可溶性糖含量變化在鹽堿脅迫2～5 d后達到顯著水平，說明外源褪黑素可促進在鹽堿脅迫下小黑麥滲透調節物質積累，有助于緩解小黑麥葉片受到逆境傷害。

表3 鹽堿脅迫條件下褪黑素對小黑麥根系可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Table 3 Effects of melatonin on the soluble sugar and soluble protein content in roots of triticale under salt-alkali stress

2.4 褪黑素處理對鹽堿脅迫下小黑麥根系AsA-GSH相關酶活性的影響

與CK相比，鹽堿脅迫處理(ST)顯著增加了小黑麥根系MDHAR、DHAR和APX活性，對GR活性影響較小；而褪黑素處理(MT)均能顯著提高這四種酶活性。在鹽堿脅迫下，與ST處理相比，添加褪黑素處理(SM)的四種酶活性總體上顯著增加，說明外源褪黑素可增強鹽堿脅迫下小黑麥清除活性氧的能力。

相同時間圖柱上不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2 鹽堿脅迫下褪黑素處理對小黑麥根系DHAR活性的影響

圖3 鹽堿脅迫下褪黑素處理對小黑麥根系GR活性的影響

圖4 鹽堿脅迫條件下褪黑素對小黑麥根系APX活性的影響

2.5 褪黑素處理對鹽堿脅迫下小黑麥根系AsA和GSH含量及AsA/DHA和GSH/GSSG比值的影響

與CK相比，鹽堿脅迫處理(ST)不同程度降低了小黑麥根系AsA和GSH含量及AsA/DHA和GSH/GSSG比值，而褪黑素處理(MT)均能提高四個指標值。在鹽堿脅迫下，與ST處理相比，添加褪黑素處理(SM)的四種指標值均不同程度增加，除AsA/DHA外，其余指標的變化均表現顯著，進一步說明外源褪黑素可增強鹽堿脅迫下小黑麥清除活性氧的能力。

3 討 論

植物抗逆研究中通過施用各種外源物質提高作物抗逆性已成為當今的熱點。褪黑素可以提高各作物的抗逆性，例如高氮環境對大豆生長發育會產生一系列的不良影響，外源褪黑素可有效提高根系的生長，增強碳水同化反應中相關酶和抗氧化的活性，提高氮代謝水平，減少細胞膜的損傷，促進了大豆各個部分干物質的積累，緩解高氮脅迫對大豆生長的迫害；在鹽脅迫下，噴施褪黑素能夠有效地緩解鹽脅迫毒害，并促進水稻幼苗生長；冬小麥種子在水分脅迫下添加外源褪黑素后能夠促進其種子的萌發，顯著提高了APX、GR活性和GSH含量，降低了GSSG含量，從而提高了GSH/GSSG比值。褪黑素可以緩解干旱迫害作用，使作物生長發育恢復正常。相關研究表明，外源褪黑素在干旱脅迫下對大豆和煙草幼苗生長以及小麥的種子萌發均起到積極作用，褪黑素可以通過增強代謝酶活性和調節內源激素，緩解脅迫導致的光合色素含量的減少和光合作用的減弱，從而減輕脅迫對光合機構的傷害，提高小麥的種子發芽率、發芽勢和幼苗干物質積累量及煙草和大豆幼苗的抗旱能力。此外，褪黑素通過激活生理系統機制來保護植物的抗壞血酸系統和谷胱甘肽循環，降低蛋白質含量，促進可溶性蛋白的基因表達。

表4 鹽堿脅迫下褪黑素處理對小黑麥根系AsA含量及AsA/DHA比值的影響Table 4 Effect of melatonin on AsA content and AsA/DHA ratio of triticale roots under saline-alkali stress

表5 鹽堿脅迫下褪黑素處理對小黑麥根系GSH含量及GSH/GSSG比值的影響Table 5 Effect of melatonin on GSH content and GSH/GSSG ratio of triticale roots under saline-alkali stress

鹽堿脅迫會對作物種子造成不良影響，有研究發現，鹽堿脅迫會使植物的種子萌發滯后，明顯降低發芽率。殷秀杰等研究表明，混合鹽堿脅迫會抑制白三葉種子的萌發。肖朝霞在大豆萌發的研究中發現，高濃度鹽堿逆境條件下，大豆種子的萌發明顯受到抑制。高立楊等研究結果發現，不同濃度的褪黑素處理在鹽堿脅迫條件下均顯著提高了垂絲海棠種子的發芽率、發芽勢和發芽指數。本研究發現，在鹽堿脅迫條件下，小黑麥東農96026的種子發芽率、發芽勢、發芽指數均顯著降低，而褪黑麥能夠有效緩解鹽堿脅迫的傷害，顯著提高種子的發芽率，與高立楊等關于垂絲海棠研究結果一致。隨著萌發天數的增加，褪黑麥能緩解脅迫條件下對小黑麥萌發及幼苗生長傷害，可增加植物的干鮮重和株高的伸長，促進了地上部的生長。這與鄒京南等在大豆根冠比上觀察到的結果一致，與在水稻、垂絲海棠上的表現也相似。鹽堿脅迫會導致可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著提高，同時也直接影響植物的生長，產生高pH值和離子毒害。王明瑤等研究發現，隨著鹽堿濃度升高，大豆的滲透調節物質含量逐漸降低，而進行褪黑素浸種后的大豆種子的發芽率，酶活性和滲透調節物質的含量都得到改善。在玉米幼苗和青菜上褪黑素也有相同的作用效果。本實驗結果表明,褪黑素在鹽堿脅迫下有效可提高小黑麥種子的可溶性蛋白和可溶性糖含量，改善滲透調節作用，有利于維持鹽堿脅迫條件下的滲透平衡，提高作物的抗逆能力。這與王明瑤研究結果一致。AsA-GSH循環是植物體內重要的抗氧化系統。孫德智等研究發現，鹽堿脅迫明顯降低番茄ASA和GSH含量以及AsA/DHA和GSH/GSSG比值。本研究中，在鹽堿脅迫條件下，褪黑素促進了小黑麥葉片和根系中APX、MDHAR、DHAR和GR酶活性增加，并提高了ASA和GSH含量以及AsA/DHA和GSH/GSSG比值，表明褪黑素能提高小黑麥抗氧化系統的運行效率和抗氧化能力。

4 結 論

褪黑素能有效緩解鹽堿脅迫對小黑麥植株的傷害，提高抗氧化酶活性和滲透調節物質的含量，降低鹽堿對細胞的傷害，有效調節細胞的滲透平衡，同時提高細胞內的AsA-GSH循環運轉中酶的活性，從而增加AsA/DHA、GSH/GSSG比值，從而增強小黑麥抗氧化能。試驗得出以200 μmol·L的褪黑素濃度為最適處理濃度。