桂枝甘草湯治療室性早搏的作用機制探討*

陳志娟，耿乃志

1 黑龍江中醫藥大學 黑龍江哈爾濱 150000

2 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院 黑龍江哈爾濱 150000

室性期前收縮（premature ventricular beats），又名室性早搏，心律失常中最常見的類型之一，是希氏束及其分支以下的異位興奮點提前進行除極從而產生的。該病在中醫學上歸類為"心悸"、"怔忡"，臨床上主要有以下幾種表現：即自覺心悸、胸悶、心跳間歇、脈結代等[1]。由器質性病變導致的室性早搏，由器質性病變引起導致的室性早搏，西醫學上治療的藥物有較為確切的療效，特別重要的是對于原發病的治療方面，以及對該類疾病進行綜合護理等各個方面，但臨床應用中仍然會受到諸多限制，如對于藥物存在不良反應和嚴格手術適應癥。因此更為安全有效的治療方法的研究意義重大。

室性早搏的中醫藥治療歷史悠久[2]。近年來，經方治療室性早搏取得良好進展，臨床較多采用的如桂甘龍牡湯、炙甘草湯、桂枝甘草湯等在基礎研究及臨床應用中均取得較大進展[3]。其中桂枝甘草湯起源于《傷寒論》，該藥方被認為是溫補心陽的藥物基礎方，且研究表明，中藥治療室性早搏使用頻率最高的藥對為甘草-桂枝藥對，有養血益氣、溫經通陽、定悸復脈的功效[4]。本文采用中藥系統藥理學方法挖掘桂枝甘草湯的活性成分及靶點，揭示”藥物-成分-疾病靶點”的相互作用，為研究室性早搏的中藥作用機制提供思路，為臨床上的廣泛應用提供理論依據。

材料與方法

1 桂枝甘草湯活性成分的收集

通過中藥系統藥理學分析平臺及數據庫（TCMSP）檢索桂枝和甘草2味藥物的主要藥理化學成分，所需成分的篩選條件設定為口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18，得到2味藥物的化學成分。

2 桂枝甘草湯活性成分對應靶標的獲取

利用TCMSP檢索桂枝和甘草的活性成分所對應的靶標，并通過Uniprot數據庫獲得靶點的標準基因的名稱。

3 室性早搏疾病靶標的獲取

通過檢索GeneCards和OMIM數據庫中與室性早搏相關的靶基因并進行去重、合并，得到室性早搏相關靶點。

4 藥物-成分-疾病靶標網絡的構建與分析

取桂枝甘草湯的活性成分對應的靶點與室性早搏疾病的靶點的交集，從而獲得藥物治療該疾病靶點，并繪制Venn圖。使用Cytoscape3.8.2軟件構建疾病-藥物-活性成分-關鍵靶點網絡關系圖，探究桂枝甘草湯治療室性早搏的作用機制。

5 PPI網絡構建

將桂枝甘草湯治療室性早搏潛在作用的靶蛋白導入STRING數據庫，設定物種為“人”，獲得各蛋白之間相互作用的網絡，參數保持默認設置，隱藏網絡中無聯系的節點，將結果以TSV格式導出，并使用R語言將每個靶標的連接數目進行排序，將前30位關鍵靶標基因用柱狀圖的形式列出。

6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將得到的潛在靶標基因ID導入DAVID數據庫，對其進行GO和KEGG通路的富集分析。首先選擇滿足P＜0.05且Q＜0.05的生物學過程和通路，使用Bioconductor平臺及R語言繪制barplot柱狀圖和dotplot點圖。

結 果

1 桂枝甘草湯活性成分的收集及潛在作用靶點預測

從TCMSP中共獲取甘草的活性成分280種，桂枝的活性成分220種。篩選后甘草活性成分92種，桂枝的活性成分7種，其中甘草活性成分中18α-羥基甘草次酸等四種成分未找到對應靶點，桂枝活性成分中過氧麥角甾醇未找到對應靶點，故桂枝、甘草關鍵有效成分共94種。通過Uniprots數據庫獲得202個候選靶標的對應基因。檢索GeneCards數據庫和OMIM數據庫中有關室性期前收縮的相關靶基因，得到3101個疾病相關基因，與藥物靶基因相映射，繪制Venn圖，得出甘草-桂枝藥對治療室性期前收縮的潛在作用靶標一共145個，見圖1。

圖1 甘草-桂枝與室性早搏共同靶點基因

2 藥物-成分-疾病靶標網絡的構建與分析

使用Cytoscape3.8.2軟件對桂枝甘草湯的活性物質和疾病靶點之間相互作用的關系等數據進行了網絡架構，并做出了可視化的處理。該網絡共包括241個節點，1241種相互關系。其中紅色八邊形代表疾病室性早搏，綠色菱形代表甘草、桂枝兩種藥物，黃色三角形代表藥物的有效成分，綠色圓形代表藥物與疾病相關的潛在作用靶標。連線代表其相互關系，見圖2。

圖2 關鍵活性成分與疾病靶標的網絡

3 桂枝甘草湯靶標蛋白相互作用（PPI）網絡的構建及分析

將桂枝、甘草中具有治療室性早搏作用的潛在靶標導入STRING數據庫，得到各蛋白之間相互作用的網絡圖，共145個節點和條邊，結果以TSV格式導出，然后使用R語言將每個靶標的相鄰節點數排序，將排名前30的靶標繪制為柱狀圖。其中AKT1的相鄰節點數為105個，IL6的相鄰節點數為98個，MAPK3的相鄰節點數為92個，VEGFA的相鄰節點數為92個，CASP3的相鄰節點數為87個。可能為桂枝甘草湯治療室性早搏的關鍵基因，見圖3，圖4。

圖3 蛋白相互作用關系網絡

圖4 PPI網絡核心基因

4 GO富集分析

GO富集分析產生的結果中，獲得了180條生物學過程，用條形圖的形式將排名前20位的生物過程表現出來。條形圖中，顏色越紅，說明富集越明顯。主要為RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合、配體激活的轉錄因子活性、磷酸酶結合、核受體活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合等生物學過程相關。可見桂枝甘草湯可通過多種生物學過程減少室性早搏的發生，見圖5。

圖5 甘草-桂枝治療室性早搏潛在作用靶標的GO富集

5 KEGG富集通路分析

使用DAVID數據庫對甘草-桂枝活性成分對應的潛在靶標進行通路分析，獲得170條通路，將前20條通路繪制條形圖。條形圖中，顏色越紅，則富集越明顯，主要涉及的通路有糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路以及HIF-1信號通路等，表明桂枝甘草湯可通過多個靶點作用于不同通路治療室性早搏。另外，乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、前列腺癌和胰腺癌、弓形體病、人巨細胞病毒感染、等多種通路提示桂枝甘草湯不僅可應用于室性早搏的治療，還可應用于其他疾病，體現了異病同治理論，見圖6。

圖6 甘草-桂枝治療室性早搏潛在作用靶標的KEGG富集通路

討 論

室性早搏作為在我國在臨床上最常見的心律失常疾病之一，其在普通人群中具有高達1%～4%的發病率[5]，且隨年齡的增長而增加，病因包括器質性疾病和功能性障礙，心臟器質性病變、自主神經重構及失衡、交感神經的興奮性增高、先天心內結構發育不良、藥物中毒以及電解質紊亂等引起心室肌自律性增高，致使提前觸發除極活動，以及局部微小折返環，從而引起室早[6-9]。

器質性病變導致室早的患者，應積極地治療本病的病因，而無器質性病變的室早患者，應首先給予生活指導，如在臨床上癥狀沒有明顯好轉時應及時給予其他藥物治，如β受體阻滯劑、非二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，但兩種藥物療效有限，且有一定副作用。而導管消融治療可作為頻發室早癥狀明顯患者的更優選擇，但手術成功率與早搏起源部位的高度有關，故部分區域消融難度較大[10]。

近年來，經方治療心律失常尤其功能性室性早搏的研究取得良好進展，室性早搏在祖國醫學中屬“心悸”“怔忡”的范疇，氣、血、陰、陽不足，致心神失養，氣滯、痰濁、血瘀阻于心脈而致氣血運行不暢[11]，綜合為本虛標實的病機，治療上則虛者補氣養心安神，實者理氣消痰化瘀為基本治則[12]，桂枝甘草湯為《傷寒論》中治療心悸病的基礎方，且研究表明，基于數據挖掘技術，中醫藥治療室性早搏最常用藥對為甘草-桂枝藥對，功能益氣養血、復陽通脈，因中藥復方在臨床上治療疾病的特點為整體觀念和辨證論治，而網絡藥理學多成分、多靶點、多通道的特征與之緊密結合，為中醫藥現代化研究提供便利。

本文利用數據庫篩選出甘草中異甘草素、槲皮素、山柰酚以及甘草酸類化合物等88種有效成分，異甘草素可通過抗氧化、抗炎、阻斷電壓依賴性鉀電流通道和L型鈣電流通道，控制或減少室性早搏的的發生，另外，甘草酸類物質通過抗氧化抗炎、阻斷心血管細胞間隙連接，保護心肌并起到抗心律失常的作用[13]，山奈酚可以發揮抑制平滑肌細胞的增殖和遷移、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗糖化、抑制脂肪的合成和減輕急性肝損傷等作用[14]。刺芒柄花素具有抗腫瘤、抗炎、耐氧化、抗動脈粥樣硬化等多種微生物學功能的特性[15-17]。花旗松素可發揮抑制NF-kB信號通路從而起到對缺氧復氧誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用[18]。槲皮素具有抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、抗氧、舒張血管等多種生物學效應[19]。

丹皮酚、柚皮苷、槲皮素可作用于AKTI靶標基因，在PPI網絡中處于網絡中核心位置，AKT1蛋白在多種生物學過程中起作用，包括增殖、代謝、細胞存活和生長等，AKT信號通路是可起到調節細胞增殖和凋亡作用的重要信號通路[20]，抑制AKT1的正常表達能對心肌細胞起到一定保護作用[21]。篩選出桂枝中花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、（+）-兒茶素、（+）-表兒茶素、紫杉葉素6種有效成分，實驗研究表明，桂枝對大鼠有較強的抗焦慮和鎮靜的作用，可通過降低大鼠的交感神經興奮性達到減少室性早搏發生的次數[22]。且研究表明桂枝甘草湯可在一定程度上抑制Na+通道，該方抗心律失常的主要作用機制可能與I類抗心律失常藥物的作用相一致[23]。多種成分作用于白介 素 6（IL6）、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGF、JUN等多種靶標基因，激活AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號通路，通過作用DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、核受體活性等生物學過程，通過保護心肌細胞，調節細胞增殖和凋亡，改進自主神經功能，抑制交感神經興奮，從而有效減少室性早搏的發生。