小柴胡湯抗慢性乙型肝炎病毒相關肝細胞癌的機制研究

凌慧，侯恩存，趙藝蔓，陳曉宇，李洲強，郭凱凱，覃鳳飛

廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 廣西南寧 530000

我國肝癌病人占全球的半數以上并不斷呈上升趨勢[1]，其主要由75%～85%的肝細胞癌（HCC），10%～15%的肝內膽管癌（iCCA）和其他兩種罕見的組織病理學類型組成。當前，HCC的危險因素包含乙型肝炎病毒（HBV）等病毒感染，烷基化劑等化學致癌物，X射線等物以及飲酒、吸煙、熬夜等生活方式和新陳代謝異常影響腫瘤微環境的2型糖尿病等[2]。深入闡明慢性HBV相關HCC發展和轉移的分子機制，在其預防、診斷和治療具有重要臨床意義。

現代研究表明[3]，小柴胡湯可通過抑制肝脂質過氧化和細胞外基質的積聚，從而起到護肝強肝之效，臨床已被廣泛應用于肝炎、肝癌等疾病。但因小柴胡湯化學成分復雜，目前對于小柴胡湯治療肝癌完整的藥效機制尚未明確。

本研究基于網絡藥理學，加以生物信息學、分子對接等手段，探索有效物質成分、核心作用靶點以及其調控的生物學機制，從而揭示的小柴胡湯抗HBV相關HCC的藥效基礎及理論依據。

資料與方法

1 小柴胡湯活性成分篩選及作用靶點

在TCMSP平臺檢索小柴胡湯諸味中藥的活性成分和相關靶點。限制OB≥30%，DL ≥0.18，符合里賓斯基的類藥五原則[4]，更能與人體組織器官結合以發揮中藥藥效[5]。

2 芯片數據檢索及差異基因分析

在 GEO 數據庫以“liver cancer”、“hepatocellular carcinomas”、“HCC”等為關鍵詞檢索，選出基因芯片GSE121248數據集，使用R軟件limma包對數據進行標準化、差異分析（限制LogFC絕對值＞1且調整adjustP＜0.05）。

3 構造小柴胡湯抗HBV相關HCC的“中藥活性成分-藥物-疾病靶標”網絡圖

將1及2步驟獲得的結果合并取交集基因，導入到 cytoscape3.7.2 中網絡分析，根據node、edge情況構造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標”網絡圖。

4 拓撲網絡構建

使用cytoscape3.7.2的BisoGenet插件里收錄的DIP，BIOGRID，HPRD，INTACT，MINT和BIND等蛋白數據庫來構建PPI。采用CytoNCA插件結合中介性和連通性等指標整合網絡拓撲結構分析，設定條件DC＞61，BC＞200，找出藥物作用于 HBV 相關 HCC 的重要基因。

5 基因本體論（GO）功能富集分析

使用R包輸入條件pvalueCutoff ＜0.05，且調整qvalueCutoff＜0.05對交集基因進行GO注釋。

6 京都基因百科全書數據（KEGG）通路富集分析

使用R軟件輸入條件pvalueCutoff＜0.05，且調整qvalueCutoff＜0.05對交集基因進行KEGG通路分析。

7 通路與基因網絡圖繪制

將上述6結果導入到 cytoscape3.7.2 中，顯示通路與基因的富集程度，制作肝癌通路與基因表、肝癌通路與基因網絡圖。

8 藥物成分-核心靶點分子對接驗證

篩選出重要成分與核心靶點進行分子對接驗證。分別從PubChem、PDB平臺下載活性成分結構mol2文件、核心基因蛋白PDB文件。利用PyMOL 2.3.4去除水分子及配體，導入AutoDock1.5.6軟件加氫，將活性成分及靶蛋白格式保存為pdbqt格式，設置盒子參數對受體和配體進行分子對接，采用Pymol 2.3.4軟件對結果可視化。

結 果

1 有效成分篩選及靶點預測

TCMSP網站得到小柴胡湯的活性有效成分共149個（見表1），其中對應柴胡11個，半夏9個，黃芩29個，人參13個，生姜3個，大棗16個，甘草88個，共有活性成分8個。同時獲取小柴胡湯各味中藥成分的所有靶點共12048個，其中柴胡的靶點2737個，半夏的靶點1302個，黃芩的靶點1203個，人參的靶點746個，生姜的靶點2225個，大棗的靶點1329個，甘草的靶點2506個。將篩選后的活性有效成分及所有藥物靶點取交集，最終整理得小柴胡湯活性有效成分藥物靶點3560個。

表1 小柴胡湯的部分活性有效成分

2 差異基因分析

與健康組對照，HBV相關HCC患者580個基因存在差別表達，上調基因167個，下調基因413個。繪制出熱圖（見圖1a）及火山圖（見圖1b）。

3 構造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標”網絡圖

將小柴胡湯與HBV相關HCC的差異基因合并，獲得30個交集基因（見圖1c）。將交集基因、化學成分導入到 cytoscape3.7.2 中，構造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標”網絡圖（見圖1d），度值最高的是柴胡、甘草、大棗都具有的活性成分槲皮素（quercetin，MOL000098），其次是山奈酚（kaempferol，MOL000422）、豆甾醇（Stigmasterol，MOL000449）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，MOL000358）等，故可認為上述成分是小柴胡湯抗HBV相關HCC的主要分子。

圖1 a正常人與HBV相關HCC患者差異基因熱圖；b正常人與HBV相關HCC患者差異基因火山圖；c小柴胡湯藥物與疾病靶標韋恩圖；d中藥活性成分-藥物-疾病靶標網絡

4 拓撲網絡

PPI拓撲分析篩選出3個標紅的CDK1、TOP2A、HSPB1重要基因，見圖2。

圖2 小柴胡湯治療HBV相關HCC基因的拓撲網絡

5 GO富集分析

GO分析共獲得278個功能富集條目，其中BP250條、CC4條、MF24條，分別選前20條富集條目繪制氣泡圖（見圖3a～3c）。其中BP主要富集在類固醇代謝；CC則集中在蛋白激酶全酶復合物；MF首要表示在氧化還原酶活性。

6 KEGG富集分析

KEGG剖析共獲取18條通路（圖 3d），通路涉及類固醇激素的合成通路，視黃醇、藥物、花生四烯酸等代謝通路，細胞衰老通路，p53、IL-17、TNF等信號通路。

圖3 a 生物過程（BP）；b 細胞成分（CC）； c分子功能（MF）；d KEGG；e 通路與基因網絡圖

7 通路與基因網絡圖繪制

從肝癌通路與基因表（表2）、網絡圖（圖3e）中可以看出可以看出 hsa00830、hsa00982、 hsa00980 、hsa05204、hsa04218是富集最多的通路，FOS、 CCL2、CDK1、CCNB1、 ADH1C、PTGS2、CXCL2、CYP2B6是顯著表達的基因。

表2 小柴胡湯治療HBV相關HCC通路

8 分子對接結果

上述顯示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇是小柴胡湯有效活性成分中degree預測靶點最多的關鍵藥效物質，CDK1、TOP2A、PTGS2、FOS、CCL2是關鍵的候選基因，且經“中藥有效成分-藥物靶點”網絡圖得知活效成分與關鍵基因存在相互作用，故選取兩者分別作為分子對接的配體和受體進行分子對接驗證，以探究二者分子層面的相互作用位點。普遍認為，對接結合分值小于-4.25 kcal·mol-1表示兩者間有一定的結合活性，小于-5.0則表示有較好的結合活性，小于-7.0 更具備強烈的結合活性[6]。通過autodock軟件進行分子對接并計算出結合能（見表3），對接結果利用 Pymol 軟件繪圖，見圖4。

圖4 分子對接

表3 小柴胡湯抗HBV相關HCC相關分子對接結合信息

討 論

雖然小柴胡湯在臨床肝癌上運用較多，本研究探討其治療的分子靶點及機理，以進一步促進臨床運用與相關實驗研究。

1 潛在有效成分

小柴胡湯的首要活性成分槲皮素，可以通過上皮間充質轉化（EMT）延緩肝癌HepG2細胞的增殖[7]，還可以通過抑制PKC、PTK、MAPK和其他信號通路來增加癌細胞對藥物的敏感性[8]。山柰酚激活TP53通路或結合雌激素受體，從而產生抗腫瘤作用[9]。豆甾醇在臨床實驗過表達調亡基因的情況下，破壞腫瘤血管的生成，具有抑制肝癌、皮膚癌等多種腫瘤生長的作用[10]。植物甾醇類β-谷甾醇不僅具有抗炎、抗氧化作用，還具有抗病毒、調免疫、抗腫瘤的作用[11]，其抗腫瘤機制涉及誘導細胞周期停滯與調亡，抑制腫瘤細胞對機體的黏附和侵入[12]。上述四種化合物均處于網絡圖的核心，并具有較高Degree，提示這些化合物可能在小柴胡湯抗HBV相關HCC過程中起主要作用。

2 潛在基因靶標

CDK1，亦稱CDC2，是一種主要參與有絲分裂細胞周期過程的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過去磷酸化激活參與調節細胞周期中S期及G2/M期[13]，若該過程運行顯著異常，會導致腫瘤細胞不斷的增殖擴散以及受損細胞的不恰當存活[14，15]。此外，CDK1在miR-1271-5p[16]、miR-378[17]靶向下抑制凋亡、增殖并加強放射敏感性。據研究報道，能抑制腫瘤增殖的CDKs抑制劑[18]是醫治腫瘤的新興領域之一。

TOP2A是一類參與改變DNA拓撲狀態、編碼Topllα蛋白DNA片段的酶蛋白，在肝癌組織高表達，且與臨床預后顯著負相關[19]。通過參與p53、癌癥和細胞凋亡信號傳導等多種途徑， 發揮原癌基因作用[20]，并對化療藥物蒽環類的療效具有預測性[21]。

FOS編碼的C-fos蛋白是AP-1的一個單體，AP-1通過JNK途徑被各種促炎性刺激物激活，進而影響細胞增殖凋亡等過程[22]。AP-1復合物亞基mu-1（AP1M1）在HBV轉染的HepG2肝癌細胞中被上調， 加速了蛋白激酶B的磷酸化和HepG2肝癌細胞增殖，是與HBV感染引起的肝癌進展有關的關鍵因素之一[23]。

CCL2 是活化炎癥、血管生成和抗凋亡的關鍵介質，參與JAK2-Stat5和p38MAPK通路，增加血管內皮細胞的通透性，促進癌細胞轉移[24]。

PTGS2是一種易被多種因素（如炎癥損傷、激素水平、致癌劑）誘導表達的即刻反應癌基因[25]，通過催化花生四烯酸釋放炎癥介質前列腺素[26]。

CCNB1，亦稱Cyclin B1，是一種調節細胞周期G2/M階段的有絲分裂調節蛋白，將其敲除或在miR-144靶向調節下抑制表達可延緩腫瘤的形成[27]。

3 富集分析

KEGG通路主要與細胞凋亡、轉移、炎癥和免疫相關。大量文獻報道，顯著富集的P53信號通路與細胞周期、DNA修復改變緊密相關，影響肝癌的發生發展[28]。持續慢性細胞衰老參與腫瘤的發生，衰老肝細胞的蓄積和其免疫防御受損所導致的衰老共存將向著HCC的方向發展[29]。IL-17信號通路與自身免疫病、自身免疫防御、調節感染、活化炎癥反應等相關[30]，另一個富集顯著的TNF信號通路涉及到下游NF-κB激活的傳導途徑[31]，參與基因轉錄、細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉移和氧化應激[32]。

4 分子對接

小柴胡湯中關鍵藥效物質與核心靶點蛋白能夠穩定的結合，表明小柴胡湯可能作用于 CDK1、CCNB2、 TOP2A 、FOS、 PTGS2、 CCL2 等靶點，調控細胞增殖和凋亡，調節免疫活性，從而抗肝癌。研究表明[33]，黃酮類化合物可以直接或間接地降落CDKs和cyclins的蛋白水平。這與本研究中“有效活性成分-藥物靶點網絡”的槲皮素、山奈酚與CDK1、CCNB2中互相作用的觀點相一致。

綜上所述，本研究通過聯合網絡藥理學分析與分子對接驗證，發現槲皮素、山柰酚為小柴胡湯的主要活性成分，以 CDK1、TOP2A、FOS、 CCL2 、CCNB1等為核心靶標，涉及代謝合成、蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、氧化結合調控等多個生物過程，并通過調控細胞周期、合成代謝、免疫炎癥信號通路發揮抗HBV相關HCC，本研究最終通過分子對接驗證了活性成分與核心靶標之間的協同抗癌效應，為后續分子層面的中藥抗癌研究提供理論支持。