流式細胞術在多發性骨髓瘤治療中的應用價值

鄧 娜，吳冠宇，楊 柳，谷和先，盛德菁，周 娜，王何懼

（馬鞍山市人民醫院血液科，安徽 馬鞍山 243000）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma）是血液科常見疾病之一，其發病率呈逐年升高趨勢[1-3]。既往多發性骨髓瘤的診斷主要依賴于骨髓細胞學、血清蛋白電泳、臨床表現及影像學改變，診斷水平相對較低，同時難以與其他漿細胞病相鑒別。近年來，流式細胞術已成為多發性骨髓瘤診斷和分型的重要依據，其能快速、準確、客觀地反映多發性骨髓瘤細胞的生物學特性，鑒別多發性骨髓瘤及其他漿細胞病，并能用于治療后多發性骨髓瘤微小殘留病（minimal residual disease，MRD）的監測，提高診斷水平，進而指導臨床治療[4-6]。有研究表明[7]，二代流式細胞術能增強MRD 的檢出率。目前，治療后的免疫表型分析已被納入多發性骨髓瘤新的療效評價標準。基于此，本研究旨在分析多發性骨髓瘤表型的特點及其在疾病不同分期和分型中的差異，分析其與骨髓細胞學等監測手段之間的相關性，進一步評價流式細胞術在多發性骨髓瘤診治中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4 月-2020年3 月在馬鞍山市人民醫院血液科住院的初診多發性骨髓瘤患者34例為研究對象，其中男22例，女12例，年齡48～88歲，中位年齡75歲。所有初診患者均完善骨髓形態（包含組化染色）、流式免疫分型、骨髓活檢、血尿免疫固定電泳及必要的影像學檢查，符合多發性骨髓瘤分型診斷標準（國際骨髓瘤工作組診斷標準-2014 修訂版）[5]。本研究經醫院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 采集初診多發性骨髓瘤患者新鮮骨髓液，調整細胞數至（0.5～1.0）×106個/ml，使用BD FACSCalibur 流式細胞儀及其配套試劑（試劑均購自美國Becton Dickinson 公司，試劑批號：347193、341025、31096、652814、652803）以及雙激光四色流式細胞分析儀檢測胞膜抗原。每管取100 μl 樣本加不同組合抗體各20 μl，同時做同型對照管，混勻，避光20 min，溶血后上機檢測分析，每管至少獲取10 000個細胞。使用CD45/SSC 進行設門，對CD38、CD138、CD19、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD10、CD33、Cyκ、Cyλ 表型的表達進行分析。流式圖中用10 的指數來表示抗原表達強弱，設十字門，表達抗原細胞≥20%判定為陽性，≥80%判定為強陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計數資料以（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞學表型特點 CD38、CD138 陽性率均為100.00%；CD45 陽性率為5.88%，其中1例患者異常細胞群表達CD45；另1例患者有2 群異常細胞，其中一群細胞表達CD45，一群不表達，見表1。

表1 34例患者異常細胞群流式免疫表型表達（n，%）

2.2 流式免疫表型與多發性骨髓瘤分型的關系CD45、CD38、CD19、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD23 的表達與疾病分型無關（P＞0.05），CD33 的表達與疾病分型有關（P＜0.05），見表2。

表2 不同疾病分型的表型差異[n（%）]

2.3 流式免疫表型與多發性骨髓瘤分期的關系CD45、CD38、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD23、CD33 的表達與ISS 分期無關（P＞0.05），CD19 的表達與ISS 分期有關（P＜0.05），見表3。

表3 不同分期的表型差異[n（%）]

3 討論

多發性骨髓瘤系血液系統惡性疾病之一，由于體內漿細胞惡性增殖產生異常免疫球蛋白而致病。近年來該疾病發病率呈上升趨勢，多發于中老年人，男性發病率高于女性，也是一種不可治愈的惡性血液病[4]。流式細胞術是一種在溶液中對單個細胞進行快速多參數分析的技術，其作為檢測工具，在過去的30年里取得了巨大的進步，使免疫系統和細胞生物學其他領域的研究獲得了較大突破[5]。隨著近年來多發性骨髓瘤診斷的不斷更新，骨髓細胞學中原幼漿細胞比例對于診斷的意義在不斷減弱，而更加看重克隆性漿細胞的占比[8]，且骨髓細胞學的主觀形態檢查已經無法滿足新診斷標準，因此免疫分型的應用更加廣泛。

CD38、CD138 作為漿細胞的主要標志，其在本研究中陽性率均為100.00%；CD45 弱表達在本研究中占比僅5.88%，但依靠這3 種免疫表型缺乏特異性，很難與正常漿細胞區分，仍需要結合其他的免疫表型進行臨床診斷。CD19 和CD56 可區分免疫表型正常和病理漿細胞[9]。既往對多發性骨髓瘤異常免疫表達的研究中也將CD19 和CD56 作為區分異常漿細胞的主要表型[10，11]。

本研究結果顯示，CD28 陽性率為28.41%，CD117 陽性率為41.18%。CD28 是T 淋巴細胞表面表達的共刺激分子，對T 細胞的活化起到重要作用，其表達被認為與增殖活性增強及骨髓、器官、組織的侵入以及高風險的細胞遺傳學異常有關，可以使多發性骨髓瘤細胞產生生長因子，降低腫瘤細胞的凋亡，并且可導致免疫細胞異常，為多發性骨髓瘤的免疫治療提供了新的靶點[12，13]。CD117 又稱c-kit，是具有酪氨酸激酶活性的造血生長因子，在正常漿細胞上表達缺失，異常表達于惡性漿細胞表面。在多發性骨髓瘤患者中，CD117 的表達是提示疾病早期和預后較差的指標之一[14-16]。

本研究結果顯示，CD20 陽性率為8.82%，CD9陽性率為41.18%，CD23 陽性率為2.94%，CD33 陽性率為17.65%。CD20 表達于除漿細胞（分泌免疫球蛋白的B 細胞）外的發育分化各階段B 細胞的表面，通過調節跨膜鈣離子流動直接對B 細胞起作用，在B 細胞增殖和分化中起重要的調節作用。CD20 在多發性骨髓瘤表達率偏低，因CD20 陽性骨髓瘤細胞具有異質性的臨床特征、細胞形態、免疫表型和細胞遺傳學特征,因此對于常規治療后的預后影響不大[17]。CD9 有多種生物學功能，其在細胞黏附、細胞運動、激活、分化、腫瘤轉移以及精卵融合等方面都發揮著重要的作用；并與多發性骨髓瘤的活動與否有關，與生存預后關系不大。CD23 是一種低親和力IgE 受體,主要表達于成熟的B 細胞和濾泡樹突狀細胞，可用于標記生發中心的活化B 細胞，在多發性骨髓瘤中表達偏低。CD33 是髓系細胞分化抗原，主要分布在髓系血細胞，特別是在分化的早期階段。研究表明[18]，多發性骨髓瘤中CD33 陽性率為10%～25%往往提示預后不良，化療和復發可以增加CD33 在多發性骨髓瘤中的表達。

此外，本研究中Cyκ、Cyλ 的陽性率分別為58.82%、41.18%，這與國內學者[19，20]提出輕鏈的同型排斥理論相符，即一個克隆的漿細胞只表達一種輕鏈，漿細胞惡性轉化后，Ig 合成異常，尤以單一成分的輕鏈合成過量為突出表現。作為鑒別正常與異常漿細胞表型的重要標志，胞漿輕鏈的表達在多發性骨髓瘤的診斷中具有重要作用[21，22]。本研究中依據差異性分析，不同分期及分型之間免疫表型大部分呈一致性，部分有差異的表型可能與本研究中病例數較少，并且分型集中于IgG 型、分期集中于Ⅲ期有關。因此，今后有待擴大樣本量后再驗證表型差異的可靠性。

綜上所述，免疫表型的分析更符合診斷標準，能更準確的區分良、惡性漿細胞，對于多發性骨髓瘤的預后及治療后的監測均有意義。